【中信期货】耐药机制,：基因在肝细胞癌索拉非尼耐药中的作用及相关细胞学机制

【摘要】目的：从分子水平探讨肝细胞癌对索拉非尼的耐药机制，寻找能够有效预测其疗效的分子标志物，提高治疗敏感性，避免治疗无效或过度治疗。索拉非尼致敏方法和克服耐药性的发展提供了新的途径。方法：1.采用浓度梯度法建立索拉非尼耐药细胞模型，通过表达谱芯片筛选耐药相关基因。2.采用实时qPCR技术检测耐药细胞内耐药相关基因的内源性表达，高内涵筛选影响细胞增殖的关键耐药相关基因。3. 构建并制备了基因RNA干扰慢病毒载体，在感染索拉非尼耐药细胞后，采用Real time qPCR和Blot技术检测基因表达的敲低效率。同时计数检测细胞生长，/7实验和流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期，比较干扰表达前后细胞增殖、凋亡和周期状态的变化，初步探讨基因的作用索拉非尼在肝细胞癌中的耐药作用及相关细胞机制。4.使用肝细胞癌大鼠模型研究体内索拉非尼耐药性。采用实时qPCR和免疫组化检测索拉非尼敏感期和耐药期基因表达的差异，

35个耐药相关基因在耐药细胞中的内源性表达显示，在索拉非中发现了32个耐药相关基因，在雾化耐药细胞中的表达丰度均较高。其次，在32个高表达基因中，20个通过比较基因敲除对细胞增殖率的影响，随机选择基因，初步筛选出具有明显增殖抑制表型的基因。，即关键的耐药相关基因：和。此外，针对这两个基因的三个RNA干扰靶点的质粒分别进行了慢病毒包装和高内涵细胞增殖检测，进一步证实了这两个基因对增殖功能的影响。具体目标。最后，实时 qPCR 验证每个单个目标的击倒效率。选择的细胞增殖抑制最显着（2.76倍，是对照组的76倍）和最高的敲低效率（达到86.1%的-1靶点）组内对照为关键耐药基因的靶点，并继续进行后续细胞功能研究。

3.以-1靶标为模板，制备RNA干扰慢病毒载体，并通过PCR和测序鉴定。将制备的RNAi慢病毒载体与RNAi慢病毒包装在一起，感染索拉非尼耐药细胞，感染效率达到80%以上。Real time qPCR在mRNA水平检测基因的敲低效率，Blot检测降低基因外源蛋白表达的靶点。是有效的干扰目标。细胞计数试验表明，敲低基因的索拉非尼耐药细胞增殖率明显受到抑制；/7试验表明，敲低基因的索拉非尼耐药细胞活性增加，凋亡细胞增加。; 流式细胞仪还显示，具有敲低基因的索拉非尼耐药菌株的细胞凋亡率增加；细胞周期检测显示，敲低基因的索拉非尼耐药株细胞处于S期。G2/M期细胞无明显变化，G1期细胞减少，提示该基因与索拉非尼耐药细胞的细胞周期显着相关。4.以大鼠肝癌细胞系成功建立ACI大鼠原位肝癌模型，用于体内研究索拉非尼耐药性。大鼠基因mRNA和蛋白质表达水平在此期间增加。同时，免疫组化结果还显示，与敏感期相比，抵抗期大鼠Ki-67和CDK4蛋白表达水平升高。以上结果进一步验证了该基因是引起索拉非尼耐药的关键基因。结论：基因是索拉非尼的关键耐药相关基因。其中，基因通过增殖、凋亡和细胞周期调控导致肝细胞癌对索拉非尼产生耐药性。