血管生成素类似物类似物耐药拟探讨索拉非尼耐药验证表达量

【摘要】：目的:肾癌是人类常见的恶性肿瘤,近年来发病率逐年上升。约 20% 的患者在初诊时已发生转移，近 30% 的局限性肾癌在肿瘤手术切除后仍有复发和转移。索拉非尼早在2006年就被国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准作为肾癌的一线治疗药物，然而，约20%的患者在首次给药时对索拉非尼产生了耐药性。先天性耐药，绝大多数剩余患者也会在 6-15 个月左右出现继发性耐药，这些因素导致索拉非尼治疗后总生存期延长有限。目前肾癌靶向治疗的难点在于耐药机制不明确，缺乏预测索拉非尼疗效的有效生物标志物，出现耐药后也没有逆转耐药的好方法. 血管生成素类似物在肾癌靶向耐药过程中的作用和机制尚未见报道。本研究旨在探讨血管生成素类似物在肾癌索拉非尼耐药过程中的作用，寻找逆转耐药的相关分子标志物和联合治疗靶点，以提高肾癌靶向治疗的疗效。效果，进一步延长患者的总生存期。研究方法1.

2.选取20例接受索拉非尼治疗的肾癌患者的肿瘤组织样本，其中10例对索拉非尼耐药，10例对索拉非尼敏感。测定-8的mRNA表达，进一步筛选与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。结合1的结果，发现它与肾癌中索拉非尼耐药的关系最大，故选择作为进一步验证的对象。3.进一步扩大样本量，验证肾癌mRNA表达与索拉非尼耐药的关系。在一组 68 例肾癌样本中研究了 mRNA 表达和对索拉非尼的反应性之间的关系。4. 在蛋白质水平上验证肾癌中表达水平与索拉非尼耐药之间的关系。选取32例肾癌组织样本（耐药16例，敏感16例）进行印迹检测，比较表达水平与索拉非尼敏感性的关系。收集136例肾癌患者（70例术后接受索拉非尼治疗，66例术后未接受辅助治疗）的肾癌资料，采用免疫组化检测表达水平并进行生存分析。5.两个独立的短发夹RNA（RNA，）用于敲除肾癌细胞系中的表达，CCK-8增殖试验，凋亡蛋白印迹试验，

6.用慢病毒转染肾癌细胞系构建稳定过表达的肾癌细胞系，用CCK-8增殖试验，用blot检测凋亡蛋白，用流式细胞仪检测细胞凋亡检测肾癌的变化癌细胞对索拉非尼的敏感性。7.将稳定过表达的OS-RC-2细胞皮下注射到裸鼠体内，构建皮下荷瘤模型。裸鼠通过管饲法（80 mg/kg/天）给予索拉非尼以模拟临床给药。每周测量肿瘤大小以绘制肿瘤生长曲线，并通过小动物的体内成像检测肿瘤大小。8.利用人类蛋白质组芯片对蛋白质进行筛选和结合，通过缩小筛选范围，最后使用蛋白质共免疫沉淀和激光共聚焦验证获得结合的蛋白质。并通过构造截断体，明确定义功能域。9.使用该方法，证明上述筛选的蛋白在促进肾癌索拉非尼敏感性的过程中发挥作用，进一步阐明介导和调节肾癌索拉非尼敏感性的具体机制. 结果1.肾癌细胞系中和mRNA表达与索拉非尼对肾癌的半抑制量相关。2.肾癌组织小样本筛查发现的mRNA表达水平与肾癌索拉非尼耐药有关。结合1的结果，

3.扩大样本量验证上述结论：在索拉非尼耐药组织和细胞系中低表达，在索拉非尼敏感组织和细胞系中高表达。4.蛋白水平的验证也证实了表达水平与肾癌对索拉非尼的敏感性有关。在高表达组中，服用索拉非尼的肾癌患者预后优于未服用索拉非尼的肾癌患者；但低表达组服用索拉非尼无效。5.敲低后肾癌细胞对索拉非尼的敏感性降低：IC50升高，凋亡降低。6.过表达增加肾癌细胞对索拉非尼的敏感性：IC50降低，细胞凋亡增加。7. 体外实验证实，过表达增加了肾癌细胞对索拉非尼的敏感性：过表达的肾癌异种移植物在索拉非尼的作用下生长更慢。8. 和 (FAK) 的类 FBG 域相互绑定。9.FAK的过表达可以促进肾癌细胞对索拉非尼的耐药，过表达可以逆转这种作用。敲低可以增加肾癌细胞对索拉非尼的抵抗力，而敲低FAK可以抵消这种作用，而使用FAK激酶抑制剂PF-不能逆转敲低引起的抵抗增加。和 (FAK) 相互绑定。9.FAK的过表达可以促进肾癌细胞对索拉非尼的耐药，过表达可以逆转这种作用。敲低可以增加肾癌细胞对索拉非尼的抵抗力，而敲低FAK可以抵消这种作用，而使用FAK激酶抑制剂PF-不能逆转敲低引起的抵抗增加。和 (FAK) 相互绑定。9.FAK的过表达可以促进肾癌细胞对索拉非尼的耐药，过表达可以逆转这种作用。敲低可以增加肾癌细胞对索拉非尼的抵抗力，而敲低FAK可以抵消这种作用，而使用FAK激酶抑制剂PF-不能逆转敲低引起的抵抗增加。

进一步研究发现，索拉非尼可抑制FAK磷酸化，促进FAK进入核内，导致p53降解；而过表达可以抑制FAK的进入核，从而抑制p53的泛素化和降解，提高p53的水平。表达。结论 在肾癌索拉非尼敏感组织中高表达，在索拉非尼耐药组织中低表达，索拉非尼在治疗高表达肾癌中具有良好的疗效。在索拉非尼的作用下，FAK进入细胞核，促进p53泛素化和降解，导致细胞产生耐药性；通过与FAK结合，影响FAK进入细胞核，抑制p53的泛素化，从而促进p53维持在较低水平。高水平促进细胞凋亡等过程，提高索拉非尼的治疗效果。因此，可作为预测肾癌对索拉非尼敏感性的生物标志物，其下游FAK入核及p53的泛素化降解也有望成为肾癌靶向治疗的新靶点，具有良好的临床应用前景。临床转化前景。