FDA批准索拉非尼细胞索拉非尼耐药的分子机制研究/TAZ

索拉非尼是一种酪氨酸激酶抑制剂（TKI），是 FDA 批准的用于晚期 HCC 的一线药物。然而，随着治疗产生耐药性是索拉非尼在 HCC 患者中失败的主要障碍。研究索拉非尼耐药的分子基础可能有助于确定克服索拉非尼耐药的合理联合疗法。

作者首先建立了索拉非尼耐药细胞系Huh7-IR/Huh7-CR和-IR/-CR。为了探索HCC细胞对索拉非尼耐药的机制，文库筛选了耐药菌株，然后将筛选出的合成致死基因与耐药菌株中表达上调的基因进行比较，得到8个候选基因。筛选了基因，包括该途径的信号分子TAZ。已知哺乳动物通路参与肝癌的肿瘤发生，YAP/TAZ作为转录共激活因子是该通路的重要效应分子。因此，作者接下来重点分析了 YAP/TAZ 在索拉非尼耐药 HCC 细胞系中的表达。WB检测发现，与敏感细胞相比，YAP/TAZ在索拉非尼耐药细胞中高表达，和长期的克隆形成实验发现，需要 YAP/TAZ 来维持 HCC 细胞对索拉非尼的耐药性。TAZ 是 HCC 细胞中索拉非尼耐药的关键因素。为了研究YAP/TAZ驱动索拉非尼耐药的分子机制，作者通过RNA-Seq分析检测了索拉非尼耐药HLE细胞中YAP/TAZ缺失后的转录组变化，发现它们参与了调控基因的脂质过氧化。显着丰富。已知索拉非尼通过阻断介导的细胞胱氨酸输入来促进细胞铁死亡。因此，作者接下来验证了 YAP/TAZ 在索拉非尼诱导的脂质过氧化中的作用。敲除 HLE 中的 YAP/TAZ 后，发现细胞 ROS 水平显着上调，脂质过氧化增加。此外，添加 -1可显着抑制脂质过氧化。长期克隆形成试验发现，添加 -1 可以抑制 YAP/TAZ 缺失诱导的细胞死亡。这些数据表明YAP/TAZ可以抑制细胞铁死亡，从而促进铁死亡。其对索拉非尼的耐药性（图 1）.

图1

为了进一步研究 YAP/TAZ 如何抑制铁死亡，作者通过比较 YAP/TAZ 敲低细胞中下调的基因与 IR/CR 细胞中上调的基因，确定了 56 个候选基因。调节铁死亡的基因。接下来，作者验证了敲除 YAP/TAZ 后 mRNA 水平和蛋白质水平显着降低。荧光素酶报告基因分析和 CHIP-qPCR 检测发现 YAP/TAZ 与启动子的 TEAD 区域结合。YAP/TAZ 的缺失可导致胱氨酸摄取受损，过表达可抑制索拉非尼诱导的 YAP/TAZ 缺陷型细胞死亡。此外，临床样本检测到与 YAP/TAZ 的表达呈显着正相关。这些结果表明，作为 YAP/TAZ /TAZ 的下游效应子参与了 HCC 的索拉非尼耐药（图 <

图 2

既往研究发现，索拉非尼不能通过YAP/TAZ通路被激活，提示存在其他因素诱导表达。已知NRF2和ATF4可通过应激诱导表达。分别敲除耐药细胞中的NRF2和ATF4发现只有敲除ATF4才能影响表达。荧光素酶报告基因系统检测到 ATF4 可以直接与其结合。敲低 ATF4 后，细胞内 ROS 和脂质过氧化水平升高。长期克隆形成实验表明，敲低ATF4后细胞活性降低，加入-1可使细胞活性恢复。此外，过表达还可以恢复细胞的活性。临床样本检测与ATF4的表达呈显着正相关。

图 3

接下来，作者探讨了在索拉非尼存在的情况下，YAP/TAZ 和 ATF4 是否会相互干扰。检测显示，敲除YAP/TAZ后ATF4蛋白水平明显下降。免疫荧光和核蛋白表达检测显示YAP敲低/TAZ后细胞核中ATF4的表达水平显着降低。众所周知，YAP/TAZ可以作为核心伴侣在细胞质和细胞核之间穿梭，促进特定因子的细胞亚定位。因此，作者随后探索了YAP/TAZ是否可以促进ATF4进入细胞核，co-IP检测发现YAP/TAZ直接与ATF4结合，进一步验证发现YAP/TAZ的核定位信号是必要的ATF4 进入细胞核。此外，临床样本检测显示YAP与ATF4的表达呈显着正相关。这些数据表明 YAP/TAZ 可以与 ATF4 相互作用并促进 ATF4 进入细胞核。为了探索 YAP/TAZ 和 ATF4 如何参与 HCC 的索拉非尼耐药，作者使用 RNA-seq 分析检测 YAP/TAZ 敲低细胞和 ATF4 敲低细胞中的共下调基因。qPCR 检测显示 ATF4 通过 ARRE 结构域与启动子结合。通过 CHIP 实验检测，发现 YAP/TAZ 可以与 ATF4 的 ARRE 结构域结合（图 4，5）. 为了探索 YAP/TAZ 和 ATF4 如何参与 HCC 的索拉非尼耐药，作者使用 RNA-seq 分析检测 YAP/TAZ 敲低细胞和 ATF4 敲低细胞中的共下调基因。qPCR 检测显示 ATF4 通过 ARRE 结构域与启动子结合。通过 CHIP 实验检测，发现 YAP/TAZ 可以与 ATF4 的 ARRE 结构域结合（图 4，5）. 为了探索 YAP/TAZ 和 ATF4 如何参与 HCC 的索拉非尼耐药，作者使用 RNA-seq 分析检测 YAP/TAZ 敲低细胞和 ATF4 敲低细胞中的共下调基因。qPCR 检测显示 ATF4 通过 ARRE 结构域与启动子结合。通过 CHIP 实验检测，发现 YAP/TAZ 可以与 ATF4 的 ARRE 结构域结合（图 4，5）.

图 4

图 5

综上所述，YAP/TAZ可以直接结合TEAD结构域或通过ATF4的ARRE结构域结合ATF4，通过抑制铁死亡促进HCC索拉非尼耐药。体内实验表明，敲除 YAP/TAZ 后肿瘤对索拉非尼的敏感性增强，体积和重量减少。此外，添加抑制剂后，肿瘤对索拉非尼的敏感性也增强。这些结果表明，敲除 YAP/TAZ 或 ATF4，或添加抑制剂可促进铁死亡，从而使 HCC 对索拉非尼敏感。

图 6

模式图如下：

模式图

YAP/TAZ 和 ATF4 通过 -