肝癌肝移植术后复发转移的有效手段将有助于提高肝癌的疗效

摘要：原发性肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。肝细胞癌的肝移植作为一种有效的治疗方法已在国际上得到广泛应用，但移植后肿瘤的复发和转移仍是限制患者长期生存的主要因素。寻找预防和治疗肝移植术后肝癌复发转移的有效手段，将有助于提高肝移植治疗肝癌的疗效。近年来，多种分子靶向药物在临床肿瘤治疗中取得了良好的效果。针对肝癌细胞中与其生长、增殖、侵袭和血管生成密切相关的异常激活的信号通路，分子靶向药物辅助治疗为肝移植术后肝癌复发转移的防治提供了新的可能。. 作为免疫抑制剂，雷帕霉素已被有效地用于肝移植后的抗排斥治疗，作为mTOR抑制剂，其抗肿瘤活性已被多项研究证实。然而，雷帕霉素的耐药性仍然是限制其临床抗肿瘤应用的主要障碍。寻求与雷帕霉素联合的其他治疗方法，有机结合雷帕霉素抗排斥和抗肿瘤的双重优势，将为肝癌肝移植术后预防肿瘤复发和转移提供良好的思路。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，能抑制多种受体酪氨酸激酶的活性，同时抑制MAPK（Ras/Raf/MEK/ERK）通路，达到良好的抗肿瘤作用。安全性和有效性已得到广泛认可。基于此，本研究旨在探讨肝癌细胞对雷帕霉素耐药的机制以及联合索拉非尼对雷帕霉素耐药的拮抗作用。

在这项研究中，我们首先观察了人肝癌细胞系对雷帕霉素的耐药性；耐药性的出现与雷帕霉素的应用引起的PI3K/AKT和MAPK信号通路的反馈激活密切相关；索拉非尼能有效拮抗雷帕霉素引起的PI3K/AKT和MAPK异常激活，增强对肝癌细胞生长的抑制作用。与索拉非尼有协同抗肿瘤作用。第1部分雷帕霉素对人肝癌细胞株生长增殖的影响目的：观察雷帕霉素对人肝癌细胞株及HCC-LM3生长增殖的影响。方法：采用MTT法检测雷帕霉素在不同药物浓度(0-/ml)和不同持续时间(24h、48h、72h)下对HCC-LM3肝癌细胞株生长增殖的抑制作用。结果：雷帕霉素抑制HCC-LM3细胞的生长和增殖具有一定的时间和剂量依赖性。）较长时间（72h），抑制率也低于35%（28.4%；HCC-LM3 34.1%）。结论：雷帕霉素对肝癌细胞株生长的抑制作用不理想，提示肝癌细胞对雷帕霉素耐药。第二部分雷帕霉素对人肝癌细胞PI3K/AKT和MAPK通路的激活目的：探讨人肝癌细胞株对雷帕霉素耐药的机制。雷帕霉素以一定的时间和剂量依赖性方式抑制HCC-LM3细胞的生长和增殖。）较长时间（72h），抑制率也低于35%（28.4%；HCC-LM3 34.1%）。结论：雷帕霉素对肝癌细胞株生长的抑制作用不理想，提示肝癌细胞对雷帕霉素耐药。第二部分雷帕霉素对人肝癌细胞PI3K/AKT和MAPK通路的激活目的：探讨人肝癌细胞株对雷帕霉素耐药的机制。雷帕霉素以一定的时间和剂量依赖性方式抑制HCC-LM3细胞的生长和增殖。）较长时间（72h），抑制率也低于35%（28.4%；HCC-LM3 34.1%）。结论：雷帕霉素对肝癌细胞株生长的抑制作用不理想，提示肝癌细胞对雷帕霉素耐药。第二部分雷帕霉素对人肝癌细胞PI3K/AKT和MAPK通路的激活目的：探讨人肝癌细胞株对雷帕霉素耐药的机制。雷帕霉素对肝癌细胞系生长的抑制作用不理想，提示肝癌细胞对雷帕霉素有抗药性。第二部分雷帕霉素对人肝癌细胞PI3K/AKT和MAPK通路的激活目的：探讨人肝癌细胞株对雷帕霉素耐药的机制。雷帕霉素对肝癌细胞系生长的抑制作用不理想，提示肝癌细胞对雷帕霉素有抗药性。第二部分雷帕霉素对人肝癌细胞PI3K/AKT和MAPK通路的激活目的：探讨人肝癌细胞株对雷帕霉素耐药的机制。

方法：采用HCC-LM3肝癌细胞株，用不同药物浓度的雷帕霉素处理2 h或相同药物浓度（50ng/ml）处理不同时间，提取蛋白。MAPK(ERK1/2)(/)和-β的变化；用PI3K抑制剂预处理细胞后，观察雷帕霉素(50ng/ml,2h)对-,-ERK1/2的影响雷帕霉素(10ng)后/ml) 24 h，提取RNA，qRT-PCR法检测-α和-p的表达。结果：雷帕霉素对HCC-LM3、总AKT和总ERK的表达无影响。 HCC-LM3细胞。作用显着。雷帕霉素对肝癌细胞AKT的激活是一个快速反应和持久的过程，并呈现出明显的时间和剂量依赖性。较低剂量的雷帕霉素作用是短期的（10ng/毫升，2h)对HCC-LM3和细胞ERK磷酸化水平没有明显上调，但当药物浓度增加或作用时间延长时，ERK的异常活化水平明显升高，并呈现一定的剂量和时间相关性。PI3K抑制剂的应用 可引起肝癌细胞AKT和ERK活化水平的下调；细胞经雷帕霉素预处理后，磷酸化AKT水平未见升高，但对肿瘤细胞ERK仍有异常激活作用，但强度略有不同。衰退。并表现出一定的剂量和时间相关性。PI3K抑制剂的应用 可引起肝癌细胞AKT和ERK活化水平的下调；细胞经雷帕霉素预处理后，磷酸化AKT水平未见升高，但对肿瘤细胞ERK仍有异常激活作用，但强度略有不同。衰退。并表现出一定的剂量和时间相关性。PI3K抑制剂的应用 可引起肝癌细胞AKT和ERK活化水平的下调；细胞经雷帕霉素预处理后，磷酸化AKT水平未见升高，但对肿瘤细胞ERK仍有异常激活作用，但强度略有不同。衰退。

雷帕霉素在转录水平和蛋白质翻译水平上调HCC-LM3和细胞中-p的表达，其中细胞-β表达的上调最为明显。结论：雷帕霉素以时间和剂量依赖性方式异常激活AKT、ERK和AKT。AKT的异常激活是PI3K依赖性的，而ERK的激活是部分PI3K依赖性的；-p表达的上调可能是雷帕霉素的异常激活。AKT 和 ERK 的重要原因。第三部分索拉非尼对雷帕霉素激活的PI3K/AKT和MAPK信号通路的抑制作用目的：观察索拉非尼单药及联合雷帕霉素对肝癌细胞株生长增殖的抑制作用；探讨索拉非尼对雷帕霉素激活的PI3K/AKT和MAPK信号通路的抑制作用及机制。方法：利用HCC-LM3肝癌细胞株，MTT法观察索拉非尼在不同药物浓度（0-15μM）和不同持续时间（24h、48h、72h）下对生长增殖的抑制作用；采用MTT法。，观察不同浓度的索拉非尼（0、2、5、10μM）和雷帕霉素（10ng/ml）在不同时间（24h、48h、72h）对生长和生长的抑制作用不同药物浓度下的增殖；细胞用不同药物浓度的索拉非尼单独处理2 h或相同药物浓度（5 μM）处理不同时间，提取蛋白，用印迹法观察-，

单独索拉非尼（5μM）和索拉非尼（5μM）+雷帕霉素（10ng/ml）处理细胞24h，提取RNA，qRT-PCR检测-β的表达。结果：MTT法结果显示，索拉非尼联合应用可显着增强雷帕霉素对HCC-LM3及生长增殖的抑制作用，且抑制作用的增强具有明显的时间和剂量依赖性。印迹和RT-PCR结果表明，索拉非尼单用可抑制肝癌细胞ERK的激活，呈剂量和时间依赖性，对AKT的激活也有显着抑制作用，但剂量或时间依赖性抑制较弱。索拉非尼联合用药可在短时间内（2μM，2h）显着抑制低浓度雷帕霉素引起的肿瘤细胞中AKT和ERK的异常激活，且抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性。性别。单独索拉非尼可显着下调肿瘤细胞中-β的表达；联合使用索拉非尼可显着下调 HCC-LM3 和雷帕霉素引起的细胞中 -β 的过表达。结论：索拉非尼联合应用可显着增强雷帕霉素对肿瘤细胞生长增殖的抑制作用。索拉非尼单独使用可以抑制肝癌细胞中AKT和ERK的激活。索拉非尼联合应用有效抑制雷帕霉素引起的AKT和ERK异常激活，

第四部分：雷帕霉素和索拉非尼对大鼠肝癌体外和体内作用的实验研究目的：在大鼠原位肝癌模型中研究雷帕霉素和索拉非尼对大鼠肝癌细胞株的体外作用。方法：采用MTT法，观察索拉非尼和雷帕霉素在不同药物浓度和不同药物浓度联合用药对大鼠肝癌细胞株生长增殖的体外抑制作用；分别给予不同药物浓度的雷帕霉素，索拉非尼、雷帕霉素+索拉非尼处理2 h或相同药物浓度处理不同时间，提取蛋白，通过印迹观察-、-ERK1/2的变化方法; 细胞用PI3K抑制剂预处理然后，观察雷帕霉素（50ng/ml，2h）、索拉非尼（5μM，2h）、雷帕霉素（50ng/ml，2h）+索拉非尼（5μM，2h）对-，-的作用ERK1/2；雷帕霉素（10ng/ml）、索拉非尼（5μM）和索拉非尼（5μM）+雷帕霉素（10ng/ml）分别作用于细胞24h后，提取RNA，用qRT-PCR。

建立ACI大鼠原位肝癌模型，将大鼠随机分为4组：雷帕霉素组、索拉非尼组、联合用药组、对照组，分别进行治疗；腹部彩色多普勒超声用于测量移植肿瘤的体积并定期绘制肿瘤。增长曲线；治疗后观察肿瘤生长、侵袭转移情况，HE染色比较各组肿瘤坏死程度，PCNA染色观察肿瘤细胞增殖情况；提取动物肿瘤蛋白，用印迹法观察-和-ERK1/2的变化。. 结果：MTT实验结果表明，雷帕霉素对大鼠肝癌细胞株生长增殖的抑制作用不理想；索拉非尼联合用药显着增强了雷帕霉素对生长增殖的抑制作用。Blot实验表明，雷帕霉素以时间和剂量依赖性方式上调细胞内AKT和ERK的活化水平；当用雷帕霉素处理预处理的细胞时，未观察到磷酸化AKT水平的增加，但未观察到磷酸化AKT水平的增加。尽管强度有所降低，但肿瘤细胞中仍然存在 ERK 的异常激活。索拉非尼单用可显着抑制细胞ERK的激活，但对AKT的抑制作用较弱，且无明显的剂量或时间依赖性；索拉非尼抑制雷帕霉素诱导的AKT和ERK异常激活作用明显，且存在时间和剂量依赖性。

RT-PCR显示雷帕霉素上调细胞中-α和-β的表达；索拉非尼单用可显着下调细胞中-β的表达，但对-α表达的下调不明显；联合应用索拉非尼可显着下调雷帕霉素在细胞中过度表达-β和-α。在大鼠原位肝癌模型中，观察到单独使用雷帕霉素或索拉非尼对肿瘤生长有显着抑制作用；抑制作用不明显。联合治疗显着增强了对肿瘤生长、侵袭和转移的抑制作用；联合治疗组对肿瘤坏死和肿瘤细胞增殖的抑制程度也明显强于单药治疗组；雷帕霉素组肿瘤ERK、AKT激活水平显着高于对照组；索拉非尼联合用药还可以显着下调体内由雷帕霉素引起的ERK和AKT异常激活。结论：雷帕霉素与索拉非尼联合应用增强了对大鼠肝癌细胞株和原位肝癌模型的抗肿瘤作用；MAPK活化的抑制是密切相关的。雷帕霉素与索拉非尼联合应用增强对大鼠肝癌细胞株和原位肝癌模型的抗肿瘤作用；MAPK活化的抑制是密切相关的。雷帕霉素与索拉非尼联合应用增强对大鼠肝癌细胞株和原位肝癌模型的抗肿瘤作用；MAPK活化的抑制是密切相关的。