体外诱导建立奥希替尼耐药的关键基因探讨耐药机制

【摘要】目的：第三代EGFR-TKI在临床试验中比第一代和第二代TKI显示出更多令人惊讶的数据。奥希替尼作为唯一获批的第三代TKI，已逐渐广泛应用于临床试验。认可并成功夺得四大指南联合推荐的一线治疗宝座。然而，作为新一代的明星靶向药物，奥希替尼最终将面临耐药问题。识别耐药机制并探索耐药后的潜在治疗策略已成为重要的研究方向。本项目拟通过体外诱导建立奥希替尼耐药细胞株/OR，利用二代测序技术寻找可能导致奥希替尼获得性耐药的关键基因，探索奥希替尼获得性耐药的分子机制。为研究EGFR-TKI获得性耐药机制提供更多的体外实验依据，进而为临床耐药患者寻找潜在的治疗策略。方法：采用体外低浓度递增剂量法诱导EGFR/双突变细胞株建立第三代EGFR-TKI奥希替尼耐药株/OR。通过细胞毒性试验确定耐药指标后，成功建立耐药菌株，首先比较亲代细胞与耐药细胞在形态学和生物学特性上的差异，包括使用CCK8、平板克隆形成清晰增殖的两种细胞系。流式分析仪检测细胞凋亡和细胞周期水平的差异，通过划痕实验和实验阐明两种细胞系迁移和侵袭能力的差异。表型差异可能导致上皮-间质转化。

首先，利用实时荧光定量PCR检测亲代细胞和耐药细胞中EMT相关分子的mRNA和蛋白水平。同时，利用RNA干扰技术分析耐药细胞系上皮间质转化的关键转录调控因子。 ，确认干扰效率后，确认下调后上皮间质转化相关分子的变化，下调后再次测定耐药菌株对奥希替尼的敏感性变化和迁移侵袭能力的变化。 -规定。初步检测了亲代细胞和耐药细胞系中EMT相关星型通路的激活水平。最后将两株细胞分别送去进行基因水平的二代测序，控制测序结果的质量，利用ICGC、CCLE数据库、SIFT、 , 并使用在线分析软件对耐药菌株进行分析。对具有单核苷酸变异的新差异突变进行危害预测评估，最后对差异基因进行KEGG通路富集分析，以寻找可能导致奥希替尼耐药的突变基因。结果：第一部分，受试者首先验证实验中使用的药物和细胞系符合受试者的实验要求，使用低浓度药物成功诱导建立了奥希替尼耐药细胞系/OR梯度法5个月。 ，其IC50约为4.5μmol/L，耐药指数为391.3。

形态学上，耐药细胞系/OR呈不规则细胞特征，失去上皮样细胞形态，多呈梭形，细胞质多由圆形空泡组成，细胞间隙扩大；在生物学上与亲代细胞相比，耐药细胞系/OR具有增殖缓慢、倍增时间延长、细胞凋亡减少、细胞周期G2/M停滞、高迁移、高侵袭等特点。根据第一部分的结果，我们推测EMT在奥希替尼获得性耐药过程中起重要作用。因此，第二部分通过检测分析亲代细胞和耐药细胞/OR EMT相关分子的mRNA和蛋白水平，证实了上皮表型分子E-的表达下调，间充质表型分子N-的表达增加，促进了EMT关键转录因子的表达增加，而与迁移和侵袭能力有关的MMP-2/9在耐药菌株中高表达。当我们下调时，我们发现了EMT反转的现象；同时，EMT逆转后，耐药细胞株/OR对奥希替尼的敏感性明显恢复，迁移能力下降。 EMT在奥希替尼耐药中的作用得到充分证明。此外，我们初步筛选了一些与EMT相关的星形通路的激活，发现Wnt/β-和NF-κB信号通路在耐药细胞/OR中异常激活，可能参与了TKI的信号转导。 -获得性耐药性。 .

第三部分，我们利用二代测序技术，在基因水平上检测出亲本细胞和耐药细胞/OR的大基因突变。共检测到54个基因突变位点，在/OR细胞系中共检测到61个突变位点，其中单核苷酸变异是最常见的突变类型。比较两种细胞系的差异突变，发现突变频率增加的位点有4个，频率降低的位点有3个，新突变的位点有13个，突变消失的位点有6个。测序结果在数据库和文献中检索，没有记录和报告所有突变位点信息，也没有发现已知的奥希替尼耐药机制，如EGFR突变、MET扩增、HER2扩增等。比较差异基因后，发现耐药菌株新基因突变位点13个，其中单核苷酸突变10个，插入突变1个，缺失突变2个。此外，还使用各种数据库来预测和评估编码蛋白质的序列、结构、危害性以及相应突变位点的通路富集。结论：体外成功诱导并建立了奥希替尼获得性耐药细胞株/OR。推测上皮-间质转化参与了奥希替尼获得性耐药过程。同时，二代测序尚未发现明确已知的耐药机制。及相关基因位点突变。