镜观察各组胞浆内自噬对肺癌细胞放疗敏感性的作用讨论

结果 TEM观察吉非替尼对肺癌细胞自噬对放疗敏感性的影响。 TEM观察到自噬体的形成。 TEM观察各组细胞质中自噬体的数量。清晰观察自噬体的独立双膜结构和自噬体等各种自噬形态变化是目前国内外检测自噬最可靠的方法和“金标准”。组中细胞结构清晰，核膜光滑，核染色质分布均匀，细胞质丰富，细胞器丰富，线粒体结构完整，γ射线清晰可见线粒体嵴，吉非替尼处理过的细胞在细胞内自噬中更活跃。肿胀和变形的空泡化自噬体的数量显着高于对照组。抑制组细胞质中的自噬体数量较少。古非替尼对肺癌细胞白细胞对放射治疗敏感性的影响。图 TEM 观察各组自噬泡数 结论 吉非替尼调节自噬对肺癌细胞放射敏感性的影响 讨论 本研究旨在通过体外实验观察靶向治疗药物吉非替尼对自噬和细胞凋亡的影响探讨细胞凋亡水平的影响，探索调节自噬表达水平干预放射细胞抑制作用的原理和规律，更好地了解细胞产生和化疗药物耐药的生物学基础，找到克服自噬的有效途径。肿瘤细胞的凋亡抗性。临床给药前定量分析抗癌药物的最佳剂量，可以减少吉非替尼的用量，从而在获得最佳疗效的同时降低其毒副作用。为了了解吉非替尼对细胞的毒性，我们使用一系列浓度的吉非替尼处理细胞系，在相差显微镜下观察，随着吉非替尼浓度的增加，贴壁细胞开始变圆并逐渐脱离生长平面漂浮细胞和死细胞增加。

相应方法检测细胞增殖抑制率从细胞增殖抑制曲线可以看出，吉非替尼单药具有抑制带抑制细胞增殖的作用，吉非替尼的作用是剂量依赖性的。一定范围内，但浓度-抑制率不同浓度的吉非替尼的生长抑制作用不同。随着吉非替尼浓度的增加，细胞的抑制率逐渐增加。抑制率不随吉非替尼浓度的增加而发生明显变化，然后加药。该浓度并未增加抑制率，但部分患者因不能耐受常规剂量的药物不良反应而放弃靶向治疗。本着“个体化治疗”的原则，进行更深入的临床实验，探索是否能选择药效峰值浓度与耐受剂量的最佳拟合点，具有重要的临床意义。实验还表明，γ射线对细胞也有抑制作用。抑制作用弱于吉非替尼，细胞增殖抑制率随着吉非替尼浓度的增加而逐渐增加。两者呈线性相关，但在该药物浓度范围内对细胞增殖的抑制作用没有明显的平台期。抑制效果明显。照射剂量之间，细胞的相对抑制率随着照射剂量的增加而逐渐增加。相对存活率逐渐下降。上文讨论了吉非替尼通过调节自噬对肺癌细胞放射敏感性的影响。抑制实验证实，在药物浓度下，细胞生长受到一定程度的抑制，但细胞活力与对照组无明显差异。因此，可以认为该药物具有足够的作用且对细胞无效的最大剂量，这与国外的报道是一致的。黑质浓度再联合γ射线照射对细胞放射增敏处理的放射增敏作用。

细胞集落形成法用于检查单独照射、单独药物和放射对细胞增殖抑制和放射敏感性的影响。在放射增敏实验中，细胞具有明显的放射增敏作用。用吉非替尼处理的放射致敏细胞减弱了放射抗性和放射损伤后细胞的损伤修复能力。细胞的放射增敏作用比吉非替尼更明显。细胞损伤后的损伤修复能力较低。吉非替尼单独或γ射线可抑制匍匐茎，联合照射可显着抑制匍匐茎细胞的克隆增殖和增殖。将细胞分组后，在显微镜下观察并拍摄各组细胞形态和生长状态，各组细胞变形和生长抑制程度也与集落形成实验结果相符，与增殖抑制作用一致每组的。肺癌的发生、发展是多因素、多基因突变引起的病理过程。稳态环境下细胞凋亡的异常抑制被认为是肿瘤发生的关键步骤，也是癌细胞耐药的重要机制之一。目前认为，适应性反应可能通过在细胞或亚细胞水平产生事件来激活细胞的信号转导系统，尤其是通路，从而导致一些可能参与细胞周期调控的基因产物的表达。增殖细胞由于其不断的增殖和分裂，始终处于一个连续的细胞周期中。细胞在各个阶段进行重要的生理活动，如复制、蛋白质合成和有丝分裂。真核细胞的周期进程需要大量细胞外和细胞内信号的协调。如果没有适当的信号，细胞将无法从一个阶段切换到另一个阶段。这个相变点称为检查点。

细胞周期有两个重要的检查点，称为相位阻滞和相位阻滞。讨论吉非替尼在调节自噬对肺癌细胞放射敏感性中的作用。肿瘤细胞的一个基本特征是细胞增殖和凋亡之间的不平衡。化疗药物杀伤肿瘤细胞的主要机制是诱导细胞凋亡，这受到电离辐射的影响。由此产生的伤害也是一个循环阻滞诱导事件。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，广泛参与发育、分化、增殖、免疫系统调节、防御和自我稳定等过程，并受到精细调控。基因组学研究表明，至少一个以上的基因与细胞凋亡有关。人类基因组的调控]。各种疾病的发生都与细胞凋亡的缺陷有关。细胞凋亡程序的启动受多种促凋亡蛋白和凋亡抑制蛋白的调控，细胞不受控制的生长和细胞凋亡信号的拮抗是​​恶性细胞发生和发展的标志。普遍存在的对化疗诱导的细胞凋亡的抗性因其凋亡抗性和死亡机制而受到越来越多的关注。吉非替尼与放射治疗的协同作用是否与其对细胞周期和细胞凋亡的影响有关尚不清楚。本实验流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率表明细胞对高剂量辐射敏感，导致产细胞分期堆积，细胞分裂减少，细胞凋亡增加，从而抑制细胞分裂增殖，促进细胞凋亡。 简单处理数小时后细胞凋亡率显着增加，但细胞周期各期的比例与对照组相比无明显变化。与对照组相比，低浓度吉非替尼联合放射干预在细胞期的比例显着增加，提示吉非替尼和γ射线可能对细胞周期阻滞的调节具有一定的拮抗作用。

由于细胞对辐射更敏感，高浓度吉非替尼诱导相位停滞，高浓度吉非替尼对细胞周期没有明显影响，因此低浓度吉非替尼和吉非替尼的放射增敏机制可能不完全通过细胞循环。调控还可能包括增加肿瘤细胞的放射敏感性和降低其在辐射损伤后的修复能力、促进细胞凋亡和抑制细胞克隆增殖等机制。一方面，一些基因产物在吉非替尼低浓度时可能表达，而在高浓度时不表达，这些基因产物可能参与了相位阻滞的形成。低浓度的吉非替尼可作为激活剂，激活信号转导系统，上调或下调某些基因的表达，导致后续放疗中细胞周期停滞，缩短损伤修复时间，降低患者的适应性反应。细胞受到辐射损伤。形式。另一方面，在高浓度吉非替尼作用下，细胞在循环期被阻断，但出现非周期性停滞。这可能与某些信号通路的激活或高浓度吉非替尼刺激的细胞中某些基因的表达有关。这方面存在一个缺陷，不能导致相位停滞的发生，但目前尚不确定这一现象是否具有扎替尼介导的白细胞吞噬作用对所有肿瘤细胞中肺癌细胞放射敏感性的影响。吉非替尼联合放疗对诱导细胞周期停滞的影响仍有待进一步研究。哺乳动物细胞的凋亡通路主要有两种，死亡受体通路，外源性凋亡通路，线粒体通路，内源性凋亡通路。

目前，各种靶向治疗措施正在研究中。这些措施包括反义寡核苷酸、核酶、小干扰、显性负突变分子拮抗剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。过表达细胞系发现吉非替尼治疗诱导促凋亡因子剂量依赖性降低。吉非替尼诱导内源性凋亡途径也称为“线粒体途径”凋亡信号。吉非替尼通过某些凋亡刺激和转录后翻译机制激活分子，从而引起水平的快速增加。活化的分子转移到线粒体膜并通过与 的相互作用而活化，引起线粒体膜通透性的变化，释放细胞色素，引发一系列导致细胞凋亡的反应。抑制和激活信号通路。提示内在凋亡通路影响突变肺癌细胞系的药物敏感性或耐药性，其调控可增强突变肺癌患者的治疗效果。机制作用后表达缺乏上调或上调不足可能是肺癌细胞耐药的重要原因。该活性不仅对细胞增殖至关重要，而且还在肿瘤进展中传递信号，例如肿瘤血管生成、远处扩散和细胞凋亡抑制。昏厥等过程发挥了关键作用。发现高表达或突变的肿瘤降低了肿瘤的放射敏感性，可以显着提高肿瘤对放射治疗的敏感性。是肿瘤细胞在细胞毒性环境中阻断凋亡信号的生存反应。这可以解释为肿瘤逃避辐射引起的死亡的机制之一……

通路异常激活 活性增强会激活下游信号通路 肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和血管生成的生物学特性增强 促进肿瘤细胞增殖和修复，抑制肿瘤细胞凋亡。非凋亡性死亡也是顺铂诱导的一种重要死亡形式。 “坏死被认为只是细胞死亡的一种被动形式。最近的研究发现，这种坏死是一种不依赖于其他凋亡介质的程序性细胞死亡。”它不是纯粹的被动细胞死亡，而是称为程序性坏死，这种细胞坏死主要发生在细胞凋亡被阻断或抑制时。目前的研究表明，耐药机制与基因再突变、上皮-间质转化、基因扩增、吉非替尼调节的自噬对肺癌细胞放射敏感性的影响增加、肿瘤微环境和结构激活有关。下游效应分子。当各种因素引起下游效应分子的结构激活和解偶联时，药物的治疗效果就会降低。然而，促凋亡蛋白参与诱导凋亡和其他继发性突变的机制仍不清楚。当细胞凋亡被激活时，由于分解细胞坏死所需的蛋白质被激活，坏死的发生受到抑制，但目前尚无检测程序性坏死的特异性分子标志物。自噬性细胞死亡也称为程序性细胞死亡。白细胞吞噬作用与肿瘤的发生、发展密切相关，大多数肿瘤患者自噬活性降低。癌症治疗中自噬和自噬细胞死亡的调控机制尚不清楚。信号通路似乎在耐药机制中起主要作用。该通路也是自噬的上游信号控制通路之一。

有学者发现自噬性死亡主要发生在细胞凋亡被抑制时，也有学者认为细胞凋亡与自噬具有因果关系。通常，自噬作为细胞抵御外部致命刺激的保护措施。但是，如果自噬的表达超过一定限度，则可能将细胞转化为一种细胞死亡的方式，诱导细胞逐渐走向“自噬死亡”的路径。细胞研究表明，抗肿瘤治疗直接诱导细胞死亡。自噬性死亡而不是通过自噬性死亡。”自噬维持生存。从以上可以看出，破坏性抗肿瘤药物或放疗不仅可以诱导细胞凋亡，还可以诱导坏死或吞噬白细胞死亡。细胞坏死和自噬性细胞死亡主要发生在细胞凋亡耐受状态。这已在淋巴母细胞、成纤维细胞、乳腺癌细胞中得到证实，但在肺癌中没有。迄今为止，关于细胞凋亡、自噬性细胞死亡和坏死之间的相互关系知之甚少，需要进一步研究。自噬体与自噬相关基因有关，是哺乳动物细胞中酵母基因的同源物，定位于表面e 前自噬体和自噬体膜，参与自噬体的形成。它现在被用作自噬体的特异性标记蛋白。参与两种泛素样蛋白加工和修饰的两种泛素样蛋白相互协调，在哺乳动物自噬小泡的形成中起关键作用，并在自噬小泡形成后继续与自噬小泡表面结合[ ] 氨基酸残基被切割以暴露末端甘氨酸残基。

这种处理称为定位在细胞质中。随后，结合自噬囊泡膜表面的磷脂酰乙醇胺，在哺乳动物泛素样酶泛素样酶的催化下，讨论了古非替尼调节白细胞吞噬作用对肺癌细胞放射敏感性的作用。电泳过程中的迁移速度快于自噬泡的含量或比例与自噬泡的数量呈正相关。我们检测到的目标蛋白是。本实验采用分子靶向药物吉非替尼和自噬抑制剂单独或联合放疗对细胞进行处理，观察细胞未处理时的少量表达。增强蛋白质合成。显着增加的蛋白质表达表明，受电离辐射损伤或受高浓度吉非替尼刺激的细胞可能通过增加自噬的表达来修复异常的细胞内结构和代谢。吉非替尼单药治疗显着抑制细胞增殖，但细胞凋亡率的增加与抑制增殖的程度不匹配。相反，吉非替尼联合放射照射较各自单独作用时自噬表达明显增加。增强，即吉非替尼增强辐射诱导的自噬上调。研究表明，靶向药物与放疗的协同作用机制主要包括增加放疗后肿瘤细胞凋亡、增强肿瘤杀伤效果、抑制非致死性放射损伤的细胞修复、固定放射损伤信号转导系统、减少肿瘤细胞等途径。磷酸化。放射线的增殖增强了放射线的作用，抑制了新生血管的形成，降低了肿瘤细胞的侵袭能力和远处转移的可能性。

在正常情况下，凋亡信号的转导最终导致细胞核和细胞质中不同底物的酶解激活，从而导致典型的凋亡形态变化和随后的细胞死亡[ .研究表明，吉非替尼诱导的细胞凋亡过程中蛋白质水平没有显着差异，提示可能不参与该过程的变化可能不涉及吉非替尼诱导的细胞凋亡和耐药性。相反，它可能与以下机制有关。一方面，可能与吉非替尼抑制哺乳动物雷帕霉素靶位点自噬相关基因，缓解自噬增加有关。细胞自噬上调后，线粒体等受损细胞器及时降解，阻断内源性细胞凋亡起始过程的激活，抑制激活和进一步的级联反应。另一方面，吉非替尼可能增加细胞产生的表达 抗凋亡作用也减少对内源性凋亡途径的刺激。该途径在自噬的诱导和抑制中起主要作用。信号转导通路系统中的相关抑癌基因，如刺激自噬的发生，该系统中的一些癌蛋白抑制自噬的发生。这种机制从另一个角度表明自噬可能是一种抑癌机制。需要进一步研究信号通路的传递。讨论吉非替尼调节自噬对肺癌细胞放射敏感性的影响。高浓度后自噬表达受到抑制，但细胞增殖实验表明，在该浓度下，细胞增殖也受到抑制，细胞抗辐射能力降低。细胞集落数比较简单 放射组显着降低细胞凋亡率，显着提高细胞凋亡率。这些结果与两组的药理作用一致，说明当自噬受到抑制时，细胞趋于凋亡。

联合辐射诱导的自噬仍然低表达，并抑制辐射诱导的自噬上调。诱导的细胞凋亡增加可能与以下两个相关基因的抑制有关。它是一种早期反应基因，可被多种生长因子和细胞因子激活，促进细胞增殖和生长。在对人肺腺癌细胞高表达的研究中发现，高表达可使细胞抵抗长春碱和紫外线引起的细胞凋亡。原因是诱导了磷酸化。抑制长春碱和紫外线诱导的肺癌细胞凋亡可显着增加前列腺素，这是激活自噬上游信号转导通路的重要原因之一。前列腺素的抑制降低了磷酸化。遗传相关。该基因是迄今为止研究最深入、研究最广泛的凋亡调控基因之一。编码的产物蛋白是一种膜结合蛋白，主要分布于核膜、内质网膜和线粒体外膜，可抑制细胞凋亡，参与细胞增殖和细胞增殖。细胞凋亡稳态的调节。许多肿瘤中的高表达抑制各种药物诱导的细胞凋亡并与临床预后相关[可能是由于其抗细胞凋亡作用，这降低了细胞对内源性途径凋亡刺激的反应并提高了转移过程中的细胞存活率。当细胞被拉伸时，它可能能够抵抗肌动蛋白解聚诱导的细胞凋亡。一方面，与放射治疗相结合，阻断了被维维抑制所阻断的磷酸化过程，从而阻断了诱导的细胞凋亡，另一方面，它降低了辐射照射后的表达。同时还具有抑制铕表达，使蛋白水平降低，解除对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，增加肿瘤细胞凋亡[ ]。

因此可以增加放射治疗诱导的细胞凋亡。线性相关分析发现细胞蛋白表达与细胞凋亡率无显着相关性。吉非替尼诱导蛋白表达增加，但抑制蛋白表达，但两者结合γ射线均能产生放射增敏作用。两者引起的细胞增殖抑制可能是通过激活细胞进入不同的死亡途径来实现的。自噬表达水平是否存在对肿瘤细胞结果具有关键影响的临界点？高自噬表达或自噬抑制如何影响后续放射损伤中的肿瘤细胞进入？敏感性通路死亡作用的探讨 凋亡、自噬性细胞死亡和细胞坏死之间的相互转化机制仍需从相关基因和特异性标志分子水平进一步探索。电镜下细胞内出现双膜自噬体或自噬泡是自噬的一种形态特征。自噬体或自噬泡的数量可以半定量自噬的表达。透射电镜结果显示，本组自噬囊泡数量明显增多，自噬小泡数量明显减少，进一步证明吉非替尼和γ射线均能显着诱导自噬小体的产生。在肺癌细胞中，同时抑制自噬，而吉非替尼增强射线诱导的自噬上调抑制伽马射线诱导的自噬上调。虽然本研究无法证实细胞放疗过程中吉非替尼诱导的自噬上调与细胞凋亡之间的明确关系，但我们证实了分子靶向药物吉非替尼诱导的自噬上调可以抑制肿瘤细胞的放射损伤后增殖潜能和修复能力增强放疗效果，为分子靶向药物联合放疗的进一步临床研究提供实验依据，具有潜在的临床应用价值。进一步的研究可能会更深入地揭示自噬与放射治疗的关系，并提出是否可以将自噬通路调控的关键节点作为分子靶点进行临床治疗或联合其他药物进行特异性靶向治疗