非小细胞肺癌服用靶向治疗药后的疗效靶点

总结：

研究背景：

肺癌是导致人类癌症死亡的主要原因之一，其中非小细胞肺癌（）约占85%-90%，大部分处于中晚期临床诊断时间。目前，常规化疗通常无效。近年来，分子靶向药物的应用取得了重大进展。在非小细胞肺癌的研究中，EGFR抑制剂及其信号通路最受关注。 EGFR家族成员在肺癌的发生发展中起重要作用。它们在40%-80%的非小细胞肺癌中过表达，与肿瘤的生长、增殖、运动、粘附、侵袭、凋亡和转移密切相关。 EGFR是HER/ErbB家族中的一种跨膜蛋白。与胞外因子结合后，可通过一系列下游信号通路，如Ras/Raf/MAPK、PI3K/Akt、Jak/等，影响下游蛋白c-Fos、c-Jun、Bad、FOXO、等，从而促进细胞分裂，增加细胞增殖、转化和转移。表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂（EGFR-TKI）可分为单靶点或多靶点。其中，临床应用最广泛、最具代表性的药物是单靶点吉非替尼。其主要作用机制是与ATP竞争EGFR上的结合位点，从而抑制EGFR磷酸化，阻断信号通路。

目前，临床共识推荐使用吉非替尼作为EGFR基因突变患者的一线治疗。因此，可考虑用于老年患者或PS评分较差的患者。然而，对于没有 EGFR 基因突变或遗传状态未知的患者没有益处。而且，经过深入研究和长期观察，专家发现很多患者服用吉非替尼后出现获得性耐药。因此，虽然服用靶向治疗药物后患者的无进展生存期有所延长，但总体生存期与化疗相似。目前针对耐药性的治疗策略主要包括①使用不可逆的EGFR抑制剂（如EKB-569），②多靶点药物联合或单用，同时阻断多个信号通路。例如，BMS)-)，或③二线化疗。虽然上述部分药物已进入临床开发阶段，但其疗效仍有待证实。

中药在我国已有数千年的历史。目前，中药广泛应用于各种疾病的防治，常与西药配合使用。在非小细胞肺癌的治疗中，中药可以增强免疫力，促进术后恢复；与放、化疗联合使用，可起到增效减毒的作用；对身体状况较差、不能耐受治疗的晚期患者，可作为维持治疗，改善整体状态。目前，与表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂配合使用，中药的主要作用是减少其毒副作用，从而保证患者治疗的依从性。痤疮样皮疹是吉非替尼常见的副作用，与疗效有关。皮疹越严重，疗效预测越好。中药对缓解皮疹有很好的效果，但同时不影响疗效。也有少数文献报道中药对EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌有协同作用，但尚无中药增加机体对吉非替尼等靶向药物敏感性的报道。

扶正抗癌方是广东省中医师吴万银主任多年治疗非小细胞肺癌的方剂。许多研究表明，非小细胞肺癌患者大多是现实与现实的混合体。临床证候以气虚、阴虚为主，也见痰湿、气滞。 “脾虚痰瘀”型患者也较多。经过长期的观察和实践，吴主任创造了这个食谱。组成如下：太子参30g、白术15g、黄芪30g、炒薏苡仁30g、甘草10g、山慈菇30g、白花蛇舌草30g、龙葵30g、石见草30g、八月领30g、蛇泡30g、姜黄15g。方中太子参补气养阴生津，黄芪补气升阳，益胃健表，白术健脾除湿化痰，炒薏苡仁健脾益气。甘草祛湿，行气补中，调和诸药。具有健脾益气、补肺化痰之功效；山慈菇清热解毒，消痈散结，白花蛇舌草，龙葵清热解毒，石间川活血化瘀，清热散结，活血理气八月蛇泡甘清热散瘀，莪术活血行气散结，七味药合用，清热解毒，化瘀散结，抑瘤。通过辨病与辨证相结合，可达到祛邪不伤正、强正不招邪的效果。所谓“脾为痰之源，肺为藏痰器”。若脾虚，则水谷之精不能有效运化，水饮结成痰，存于肺中。气虚血瘀，久而久之则成血瘀，则成为痰瘀互结的证候。此方用太子参、白术、黄芪、甘草等土培土产金，一方面阻断痰饮之源，另一方面可修身正气。因此，它与西方医学方法（如手术和化疗）结合使用。 ，既能提高效率，又能降低毒性。初步临床观察提示，扶正康爱方作为二线治疗的吉非替尼疗效明显优于二线化疗。因此，认为该方对吉非替尼治疗非小细胞肺癌可能具有增效或增敏作用。

研究目标：

1.临床部分：纳入拒绝接受一线化疗的非小细胞肺癌患者，给予扶正康爱方联合吉非替尼，理解扶正康爱方联合吉非替尼为非小细胞肺癌患者。肺癌一线治疗的疗效，并与国内外已有的吉非替尼一线治疗非小细胞肺癌的文献报道进行比较。这样可以为后续的临床治疗选择提供指导，也可以为两种药物的更有效使用提供依据和指导。

2.实验部分：使用对EGFR-TKI不同敏感性的3种非小细胞肺癌细胞系（A549、PC9、）进行体外实验进一步了解：①扶正康爱方联合吉非替尼对非小细胞肺癌患者能否达到增效增敏的效果； ②不同类型EGFR基因突变对非小细胞肺癌的治疗效果及机制； ③为进一步的临床研究和动物研究提供理论依据。

研究方法：

1.临床部分：根据纳入标准，选择51例拒绝化疗的未经治疗的非小细胞肺癌患者。入组前患者PS评分0～3分，无脑转移或无症状性脑转移，骨髓、心、肝、肾功能正常。患者给予扶正抗癌汤 po bid 和吉非替尼 po qd 治疗。治疗3个月后观察客观缓解率（ORR）、无进展生存期（PFS）和一年生存率（1年）。评估患者无疾病进展并继续治疗，并随访至疾病进展或死亡。使用统计分析软件.0进行分析。对患者主要特征、近期疗效、1年评价采用描述性分析，PFS和MST采用-分析。

2.实验部分：选择人A549、PC9、肺癌细胞系作为研究对象。 PC9是EGFR-TKI敏感株，A549是EGFR-TKI低敏感株和EGFR-TKI耐药株。细胞通常在 RPMI-1640 培养基中生长。制备大鼠含药血清（空白组、低剂量中药组、高剂量中药组、低剂量中药加西药组、高剂量中药加西药组） 根据预实验结果，加入不同浓度的含药血清对细胞进行不同时间的培养。 CCK8法测定扶正康爱方和吉非替尼对肺癌细胞增殖的抑制作用；流式细胞仪检测扶正康爱方和吉非替尼对肺癌细胞的细胞周期和凋亡变化； EGFR、MAPK、Akt及其磷酸化蛋白在EGFR及其下游通路PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK等信号通路中的表达。

结果：

1.临床科

(1）临床特征

51例PS0-3分的III/IV期非小细胞肺癌患者均来自广东省中医院肿瘤科住院、门诊。患者于 2009 年 7 月至 2011 年 9 月纳入研究，共有 8 例因无法随访而退出组。实际可评价疗效的43例中，已有16例死亡，其余27例正在随访中。患者特征以腺癌、女性及老年患者为主。

(2）近期效果

治疗3个月后评价，有效率（ORR）为37.2%，控制率（DCR）为72.1%。

(3）终生

截至最后一次随访，无进展生存期为 10.78 个月；中位生存期为 10.0 个月；一年生存率为 55.56 %。

2.实验部分：

(1）CCK8法检测不同浓度含药血清对细胞增殖的影响

含吉非替尼的血清在不同时间点和浓度下对A549的增殖抑制作用较差，处理72小时后对PC9细胞的增殖抑制效果良好。扶正康爱方含药血清的高、低剂量在72h对A549、和PC9细胞株的增殖有不同程度的抑制作用。中西医结合组A549和细胞株治疗72小时后优于纯西药组，PC9细胞株治疗72小时后有抑制增殖的作用，但效果相近到西医组。扶正康爱方含药血清与吉非替尼在体外不同时间点、不同浓度对人肺癌细胞株A549、和PC9细胞的增殖有抑制作用，一般72小时效果最佳结果提示扶正康爱方可能对A549及细胞系有吉非替尼增敏作用。

(2）流式细胞仪检测扶正药血清对细胞周期的影响

扶正康爱方和含吉非替尼的血清可在体外不同程度地影响人肺癌细胞系A549、和PC9细胞的周期，并阻断G0/G1期的细胞。某些细胞周期发生变化。

(3）流式细胞仪检测含药血清对细胞凋亡的影响

扶正康爱方及含吉非替尼的血清可影响体外人肺癌细胞A549、和PC9细胞的凋亡。其中PC9和PC9有轻微的凋亡诱导作用，而A549有较强的凋亡诱导作用。

(4） Blot检测含药血清对EGFR、PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表达的影响 p-MAPK的下调提示扶正康爱的增殖抑制作用对该细胞系的配方可能通过抑制EGFR及其下游通路Ras/Raf/MAPK的激活来实现。这两种药物作用于PC9后，p-Akt的下调发生。提示扶正康爱的抑制作用。通过抑制EGFR下游通路PI3K/Akt的激活，可以实现对细胞系的配方。

研究结论：

1.临床部分：扶正康爱方联合吉非替尼一线治疗晚期非小细胞肺癌，较单药吉非替尼可延长无进展生存期。其客观有效率略优于亚洲同类研究结果。

2.实验部分：扶正康爱方联合不同浓度吉非替尼72h对不同细胞系均有杀伤作用，优于单药吉非替尼。扶正康爱方联合吉非替尼对不同细胞系表现出不同的增殖抑制（细胞周期变化）作用。扶正抗癌方联合吉非替尼对不同细胞系有轻微的促凋亡作用。扶正康爱方联合吉非替尼对A549及细胞系的作用可能是通过Ras/Raf/MAPK信号通路，而对PC9细胞的作用可能是通过PI3K/Akt信号通路。