1.单抗敏感性单抗的标志物单抗治疗单抗

1. 本发明属于生物医学领域，具体涉及一种预测直肠癌患者对贝伐单抗敏感性的生物标志物。

背景技术：

2. 直肠癌()是指发生在直肠齿状线以上至直肠与乙状结肠交界处的恶性肿瘤。我国80%以上的直肠癌发病发生在肛门附近，直肠指检可发现。直肠癌的病因尚不清楚。大多数直肠癌由腺瘤性息肉演变而来，并经历增生、腺瘤、癌变和相应的染色体变化的各个阶段。致癌作用涉及多个基因。虽然其病因尚不明确，但其相关的高危因素正逐渐被认识。

3. 直肠癌的治疗应采取个体化、综合治疗的原则。医生会根据患者的身体状况、肿瘤病理类型、浸润范围（分期）有计划地采用多种治疗方法，以最大限度地从根本上治愈肿瘤，提高治愈率。直肠癌全系膜切除术（tme）最早由英国提出，现已成为直肠癌的标准治疗方法。局部晚期直肠癌 (larc) 患者的标准治疗是放疗和化疗 (crt)，然后是全系膜切除术。通过这种治疗，30%的患者会在治疗结束后的5年内死于局部和远处复发。为了克服这个问题，

4. (,, ) 是一种重组人源化单克隆抗体。2004年2月26日获得FDA批准，是美国第一个获准上市的抑制肿瘤血管生成的药物。目前的研究表明，igg1抗体可以通过体内外检测系统与人血管内皮生长因子（vegf）结合，阻断贝伐单抗的生物活性。最初贝伐单抗适用于治疗结直肠癌。近年来，在直肠癌患者中获得了贝伐单抗抗血管生成的直接证据。这种抗血管生成药物和 crt 的组合可能优于单独治疗。然而，贝伐单抗对直肠肿瘤的确切作用尚未完全阐明，

技术实现要素：

5. 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是提供一种预测直肠癌患者对贝伐单抗敏感性的标志物及其应用。本发明提供的标志物在预测直肠癌患者对贝伐单抗的敏感性方面具有较高的敏感性和特异性，可作为指导术前治疗方案的新标志物。

6.预测方法

7. 一方面，本发明提供了检测一种或多种dtd2、表达水平的试剂在制备预测受试者对贝伐单抗敏感性的产品中的应用。

8. Said 在对贝伐单抗敏感的患者中高度表达。

9. dtd2 在对贝伐单抗敏感的患者中低表达。

1 0.在对贝伐单抗敏感的患者中表达较低。

11.优选地，高表达是指该标志物的表达水平大于其在健康对照人群中的表达水平，且至少高于对照表达水平1.1倍，对于例如，至少1.1次，1.2次，1.3次，1.4次，1.5次，1.6次次，1.7

次，1.8次，1.9次，2.0次，2.1次，2.2次，2.3次， 2.4次、2.5次、2.6次、2.7次、2.8次、2.9次、3.0次、3.1次、3.2次、3.3次、3.4次、3.5次或更多。

12. 本发明中的“敏感性”是指患者的病情是否可以通过贝伐珠单抗治疗得到改善；优选地，实现完全缓解(,cr)。在进行预测时，只需在贝伐单抗给药前测量受试者样本中标志物的表达水平即可。

13. 如本文所用，术语“施用”是指通过本领域已知的适合于施用治疗性抗体的任何方式向需要此类治疗或医学干预的患者施用贝伐单抗。非限制性给药途径包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部、皮内、鼻内或支气管内（例如，通过吸入）途径。

14. 优选地，受试者是哺乳动物，例如牛、马、羊、猪、犬、猫、啮齿动物、灵长类动物。

15. 优选地，受试者是人。

16. 优选地，受试者是直肠癌患者。

17. 更优选地，受试者是晚期直肠癌患者。

18. 优选地，检测表达水平的试剂包括检测mRNA表达水平和/或蛋白质表达水平的试剂。

19. 优选地，所述检测包括定量或定性检测。

20.优选地，所述检测mRNA表达的试剂包括以下方法中使用的试剂：基于PCR的检测法、杂交法、杂交法、点杂交法、荧光原位杂交法、DNA微阵列法、aso法，高通量测序平台法。

21.优选地，基于PCR原理的检测方法包括以下至少任一项：提取RNA的步骤，将mRNA逆转录成cdna的步骤，以及测定cdna含量的步骤.

22. 优选地，测量cdna含量的方法包括但不限于pcr、rpa、sda、lamp、had、near、mda、rca、lcr、ram。

23. 优选地，所述检测mRNA表达的试剂包括特异性引物和/或探针。

24.> 优选地，所述探针包括杂交探针和水解探针(探针)。

25. 优选地，探针的两端都连接有猝灭基团和/或荧光基团。

26.优选地，所述荧光基团包括但不限于fam（羧基荧光素，绿色荧光）、fitc（异硫氰酸荧光素，）、tet（四氯荧光素）、

－6－

羧基荧光素, ), hex (六氯

－6－

甲基荧光素, ), joe(2,7

－

二甲基

－

4、5

－

二氯

－6－

羧基荧光素）、罗丹明（染料如r110、红色等）、rox、染料、阿托染料、染料、染料（如cy2、cy3、cy3.5、cy3b、cy5、cy5.@ >5，cy7，cy7.5.7@>，染料，染料，刚毛染料，虹膜染料，染料，染料，染料。

27.优选地，本文所述的猝灭基团包括但不限于3'

－

烧烤

－

650( ), bhq

－

0(洞 0, 3'), bhq

－

1(洞 1, 3'), bhq

－

2(洞 2, 3'), bhq

－

3(洞 3, 3'), bhq

－

1(孔

－

1,5'), bhq

－

2(孔

－

2,5'), bhq

－

3(孔

－

3,5'), atto 540q, atto 575q, atto 612q。

28.优选的，检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂： blot

(blot)法、酶联免疫吸附法()、放射免疫法(ria)、夹心法、免疫组化染色、质谱法、免疫沉淀分析、补体固定分析、流式细胞仪荧光边缘技术和蛋白质芯片法。

29. 优选地，检测蛋白质表达量的试剂包括特异性抗体或其片段，该特异性抗体或其片段可以与蛋白质特异性结合。

30. 优选地，所述检测蛋白表达量的试剂还包括二抗，其可与上述特异性抗体或其片段结合并显色。

31.优选地，显色剂体现为显色剂，显色剂包括但不限于荧光染料（包括荧光分子）、化学发光标记物、荧光素酶、金属离子以及生物素、放射性同位素，在紫外光谱中吸收的分子，可以在近红外辐射中吸收的分子，或可以在远红外辐射中吸收的分子。

32.>优选地，荧光染料包括但不限于罗丹明、对甲酚、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基-对甲酚、羧基-对-甲酚、对甲酚、甲基对甲酚、磺基对甲酚、氨基罗丹明、羧罗丹明、氯罗丹明、甲基罗丹明、磺罗丹明、硫若丹明、花青、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫碳菁、部花青、

33.优选地，化学发光标记包括但不限于过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、水母发光蛋白、功能化铁

－

卟啉衍生物、鲁米那、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、磺胺类等。

34.优选的荧光素酶包括但不限于跳蚤长腹水()荧光素酶、海肾()荧光素酶、腰鞭毛荧光素酶、萤火虫荧光素酶、真菌荧光素酶、细菌荧光素酶和萤火虫()荧光素酶。

35. 优选地，抗体或其片段也可以直接与显色剂结合，检测到显色剂表明蛋白表达。

36. 优选地，该产品还包括用于收集和/或处理样品的试剂。

37. 优选地，样品包括：血液、血清、血浆、全血、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊液、眼泪、鼻上皮细胞、痰液、组织、粘液、淋巴液、细胞液、腹水、胸水、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。

38. 优选地，样品是组织。

39. 优选地，所述组织样本可以通过活检获得，例如包括通过切割、切片、手术或穿孔获得。

40. 套件

41. 另一方面，本发明提供了用于预测受试者对贝伐单抗的敏感性的试剂盒。试剂盒包括上述测试对象之一，dtd2、 或多种表达试剂。

42. 优选地，所述试剂盒还可以包含以下任意一种或多种：mrna表达水平辅助检测试剂、蛋白表达水平辅助检测试剂、mrna表达水平辅助检测仪、蛋白表达水平辅助检测设备。

43.优选地，用于辅助检测mrna表达的试剂包括但不限于：用于可视化引物对应的扩增子的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳或酶联凝胶法，化学发光、原位杂交、荧光检测等试剂使扩增子可视化、rna提取试剂、逆转录试剂、cdna扩增试剂、标准曲线制备标准品、阳性对照、阴性对照。

44.优选的，蛋白表达的辅助检测试剂包括但不限于：封闭液、抗体稀释液、洗涤液

缓冲液、显色终止液、制备标准曲线的标准品。

45.系统

46. 另一方面，本发明提供了一种用于预测受试者对贝伐单抗的敏感性的系统。该系统包括一个计算装置，用于通过多个表达水平的检测结果判断受试者对贝伐单抗的敏感性。

47.优选地，该系统包括用于输入dtd2、中的一个或多个表达式的输入装置。

48. 优选地，该系统还可以包括输出设备，用于输出预测结果。

49. 优选地，该系统还可以包括用于检测mRNA和/或蛋白质表达的检测装置。

50. 优选地，该系统还包括评价结果发送单元，可将受试者的评价结果​​发送给患者或医务人员可以咨询的信息通信终端设备。

51.标记组合

52. 另一方面，本发明提供一种标记组合，即+dtd2或+或dtd2+。

53. 同时，本发明提供了上述试剂盒、系统和标志物组合在制备用于预测受试者对贝伐单抗的敏感性的产品中的用途。

54.方法

55. 另一方面，本发明提供了一种用于预测受试者对产品中贝伐单抗的敏感性的方法，该方法包括通过受试者中的一个或多个，dtd2、检测每个表达水平的结果判断受试者对贝伐单抗的敏感性。

56. 优选地，该方法是在使用贝伐单抗前检测受试者样品中一种或多种dtd2、的表达水平，以确定受试者对贝伐单抗的敏感性。

57. 如本文所用，“贝伐珠单抗”一词涵盖满足在美国、欧洲和日本中选择的国家或地区获得相同或生物相似产品的上市许可所需的要求的那些。相应的抗 vegf 抗体或抗 vegf 抗体片段。

图纸说明

58. 图1为差异分析结果，a:,b:dtd2,c:，纵坐标为基因表达水平。

59. 图2为预测受试者对贝伐单抗敏感性的roc曲线，纵坐标为敏感性，横坐标为特异性。

60. 图3是dtd2预测受试者对贝伐单抗敏感性的roc曲线。纵坐标为灵敏度，横坐标为特异性。

61. 图4为预测受试者对贝伐单抗敏感性的roc曲线，纵坐标为敏感性，横坐标为特异性。

62. 图5是+dtd2预测受试者对贝伐单抗敏感性的roc曲线。纵坐标为灵敏度，横坐标为特异性。

63. 图6为+在预测受试者对贝伐珠单抗敏感性的roc曲线，纵坐标为敏感性，横坐标为特异性。

64. 图7为dtd2+预测受试者对贝伐单抗敏感性的roc曲线，纵坐标为敏感性

度，横坐标为特异性。

详细说明

65. 下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例并不代表对本发明保护范围的限制。

66.示例1、 筛选预测标记

67.1、数据下载及实验科目

68.从geo数据库下载的基因表达数据，具体链接在

－

地球仪

－

/? =+。

69. 上述数据库研究中，59例患者在接受贝伐珠单抗治疗前保留了肿瘤组织，后期接受全系膜切除术（，tme）手术时，根据患者的治疗状态/五级分类将患者分为两组：完全缓解组（，cr），也称为响应者，在数据库中标记为r，治疗失败组（非

－

, Nr)，也称为无应答者，在数据库中标记为 nr。

70. 最终收集到21个响应者样本和26个非响应者样本；此外，还对 nj 04/、rvs 09/002m 和 nj 04/ 三个样品进行了反复测试，以消除批次效应。最后nr：r=27:23。

71.2、数据分析

72. 得到测序结果后，使用r软件中的“”包进行差异表达分析。差异基因的筛选标准是p。表1. 基因表达状态

[0074] 平均表达水平p。

－

0...

－

0......

[0075]

2、 验证标记和标记组合的预测效果

[0076]

使用r语言proc包绘制接收器操作曲线（roc），计算auc值、灵敏度和特异度，判断标志物的预测功效。dtd2、、+dtd2、+、dtd2+的roc曲线如图2所示

－

如图7所示，auc值如表2所示。

[0077]

表2.标记或标记组合的auc值

[0078]

标记/组合...0...

[0079]

以上结果表明，本发明提供的标志物可以预测直肠癌患者对贝伐单抗的敏感性。

具有很高的临床应用价值。

[0080]

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于以其他形式限制本发明。任何熟悉本行业的人员都可以利用上述公开的技术内容，变换为具有等效变化的等效实施例。对以下实施例，基于本发明的技术实质，在不脱离本发明方案的内容的情况下，所作的任何简单的修改或者等同的变化，均应包含在本发明的保护范围内。