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顺铂联合吉非替尼治疗吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的协同机制研究⑧论文作者签名：主管签名：——唯一审稿人1：匿名审稿人2：匿名审稿人2：审稿人3：审稿人4：审稿人5：隐身复核二院委员2：徐荣臻教授浙江大学医学院委员3：詹金彪教授浙江大学基础医学院委员4：郭勇教授浙江省中医院委员5：委员6 : 辩护日期: 2015 年 11 月 30 日 (m.',-': 一●■●·e:::::: 一位 Prof. —o——f——Z——h——e—j ——i——a——n——g ——U—— ——n——i——v——e——r——si-ty——————.——…… ... ——(Ce):Prof.豇=——Prof.—,:Prof.,:Prof.::2015.11.30,浙江大学研究生论文原创性声明 本人声明，所提交的论文是本人在导师指导下的研究工作和研究成果。

除文中特别标注和承认的地方外，论文中不包含其他人已发表或撰写的研究成果，也不包含用于从十子盘堂或其他教育机构获得学位或证书的材料。与我一起工作的同志在论文中做了明确的解释，并对为本研究做出的贡献表示感谢。论文署名作者：髟≮署名日期：基金会∥/年/沙月硼论文著作权授权书本论文作者充分理解巨子盘堂保留保留并将本论文副本送交国家有关部门或机构及磁盘的权利，允许查阅和借阅文件。本人授权十字盘堂将学位论文的全部或部分内容编入相关数据库进行检索和传播，并通过影印、缩小或扫描等复印方式对学位论文进行保存和编纂。（本授权书解密后用于保密论文） 论文作者签名： 签名日期：工厂f，第一年/天，浙江大学博士。毕业论文致谢 致谢五年的高手和博学>--j 职业生涯一眨眼就结束了。在这个丰收的季节，向所有帮助和关心过我的老师、同学、亲朋好友表示最诚挚的谢意！首先，衷心感谢我的导师张素湛教授和黄建金教授，能成为你的学生是我最幸运的事！张素湛老师是我的博士生导师。您不仅教会了我如何科学严谨地做科学研究，更教会了我如何做一个思维严谨、言行善待患者的人。博士，您渊博的学识，严谨的学术态度，广阔的视野，敏锐的思维，宽厚仁慈的胸怀，诚恳正直的行为准则，一直感染着我，使我受益匪浅。你说的我永远铭记在心：“你必须用自己的个人成长带动大家一起成长，才能充分实现自己的价值！”。也教会了我如何以严谨的思想和体贴的言行对待患者。博士，您渊博的学识，严谨的学术态度，广阔的视野，敏锐的思维，宽厚仁慈的胸怀，诚恳正直的行为准则，一直感染着我，使我受益匪浅。你说的我永远铭记在心：“你必须用自己的个人成长带动大家一起成长，才能充分实现自己的价值！”。也教会了我如何以严谨的思想和体贴的言行对待患者。博士，您渊博的学识，严谨的学术态度，广阔的视野，敏锐的思维，宽厚仁慈的胸怀，诚恳正直的行为准则，一直感染着我，使我受益匪浅。你说的我永远铭记在心：“你必须用自己的个人成长带动大家一起成长，才能充分实现自己的价值！”。

黄建锦老师是我的硕士生导师，博士生导师。共同主管。感谢您在这5年里对我的关爱，不仅在科研和临床上，也在我的生活中。在低迷时期，您继续鼓励我。在人生的三个混乱阶段，你不断地指引着我走向正确的方向，同学们都觉得莫名其妙。特别感谢肿瘤科丁玲对我生活的帮助。感谢您与我沟通未来的计划并鼓励我。谢谢郑舒教授，郑校长，你们淡泊清明，沉静而深远。您以渊博的学识、博大的胸襟和孜孜不倦的长辈风度，为弟子孙子树立了人生榜样。特别感谢陈一丁女士，潘涛姊妹、许文红姊妹、董彩霞小姐、陈志刚弟兄、胡汉光弟兄、翁珊珊医生、钟贤弟兄等在我的临床工作中给予的无私帮助和指导。感谢癌症研究所彭家平、董琪等老师对我实验的技术支持。感谢胡慧勇师兄、田伟师兄、傅华华师姐、张媛媛师姐、阮淑琴师姐、高阳师兄、胡一旺师兄、张彪师兄、甘以超同学、徐静同学、学长谢飞弟兄、谭春文博士、郑维伟博士等为他们的项目和实验提供技术援助和指导。感谢您的浙江大学博士论文。谢谢朱春鹏，易承豪，以及王发良对我的项目进展和实验技术的无私帮助，以及一路上的烦恼和疲惫快乐的奋斗和陪伴。谢谢段寅，研究组的小辈小姐姐们，还有1307室的小哥哥小姐姐们，是这几年并肩工作的大家，让我度过了既快乐又压力的时光，辛苦而有收获。

最后，感谢我的父母和姐姐多年来的无微不至的照顾。因为有你们的支持和鼓励，我才能安心无畏地追求自己的梦想。“及时给予鼓励，时间不会善待他人。” 博士阶段只是人生的一个短暂时期。新的旅程已经在我面前开始了。我将继续以饱满的热情投入到新的工作和生活中。Ⅱ 潘驰，杭州，2015年10月。浙江大学博士论文中文摘要，浙江医科大学第二医院，中文摘要 研究背景 在全球范围内，肺癌的发病率和死亡率仍居所有癌症之首。近年来，我国肺癌的发病率呈上升趋势。其中，非小细胞肺癌（）约占肺癌总数的80%。过去，晚期治疗主要以含铂化疗为主，但有EGFR。TKI药物的出现大大提高了EGFR敏感突变患者的生存时间，但继发耐药是EGFR。TKI治疗后的最大问题。对于哪些EGFR-TⅪ耐药患者可以借鉴EGFR。TKI联合含铂化疗有利于提高治疗敏感性和延长生存期。目前尚无明确的分子分类，临床研究也有不同的结论。例如，大样本临床研究表明EGFR-TKI联合含铂化疗没有协同作用，但也有不少临床报道称，一些耐药患者可以借鉴EGFR。-TKI联合含铂化疗的获益表明EGFR-TKI联合含铂化疗的协同作用具有选择性，存在一些敏感人群。然而，目前单一的EGFR基因分型无法准确预测和筛选出有效人群。

这是由于我们的EGFR。TKI联合含铂化疗的协同机制尚不清楚，尤其是含铂化疗的核心药物顺铂与EGFR-TKI的相互作用机制尚不清楚。因此，本研究将研究吉非替尼与顺铂的联合作用，探讨其在EGFR-TKI耐药中的协同作用机制。实验方法与结果我们选取了三个EGFR-TKI耐药细胞系（、A549和）111浙江大学博士论文中文摘要作为研究模型，首先通过PCR扩增测序获得EGFR外显子18.21和K-ras外显子2- 3基因序列，验证细胞EGFR和K。ras基因均为野生型，A549细胞为EGFR野生型，K. . 2. G12S突触型，细胞为21，外显子。20. 突变体，K。ras 野生型。通过MTT法和AV/PI流式细胞术，三种细胞系均对吉非替尼耐药，对顺铂的敏感性较低。我们进一步将吉非替尼和顺铂同时应用于三种细胞系，使用 MTT 方法和 Chou。中值药效法计算各细胞系的联合指数，发现吉非替尼与顺铂联合对细胞有协同作用，对A549细胞有混合作用（即低浓度拮抗作用和高浓度协同作用） ）。它对细胞有拮抗作用。使用MTT方法和Chou。中值药效法计算各细胞系的联合指数，发现吉非替尼与顺铂联合对细胞有协同作用，对A549细胞有混合作用（即低浓度拮抗作用和高浓度协同作用） ）。它对细胞有拮抗作用。使用MTT方法和Chou。中值药效法计算各细胞系的联合指数，发现吉非替尼与顺铂联合对细胞有协同作用，对A549细胞有混合作用（即低浓度拮抗作用和高浓度协同作用） ）。它对细胞有拮抗作用。

通过MTT法、细胞3D培养和AV/PI细胞流式细胞术发现，吉非替尼预处理只能增强顺铂对细胞和A549细胞的抗肿瘤和诱导凋亡能力，对细胞没有影响。动物模型实验也验证了顺铂联合吉非替尼对A549细胞肿瘤有协同抗肿瘤作用，但对细胞无协同作用。实验也证实，吉非替尼预处理后顺铂能更显着地诱导细胞和A549细胞。3 和。3 表达，但对细胞没有这种影响。提示吉非替尼联合顺铂的协同作用可能取决于吉非替尼对顺铂的致敏作用，具有选择性。然后，我们研究了吉非替尼增强顺铂敏感性的机制。通过PCR扩增和测序，EGFR和K。ras基因的重测序发现顺铂对EGFR和K有影响。ras基因状态没有影响。试验发现，顺铂联合吉非替尼在A549和A549细胞中EGFR/Akt/Erk/PTEN//的表达或激活没有差异，但吉非替尼可选择性抑制A549细胞的DNA。PK的磷酸化不能抑制细胞的表达。MTT法检测细胞活力，发现细胞被DNA覆盖。用PK抑制剂刺激后，顺铂对吉非替尼和A549细胞的致敏作用消失，对细胞无作用。ras 基因状态没有影响。试验发现，顺铂联合吉非替尼在A549和A549细胞中EGFR/Akt/Erk/PTEN//的表达或激活没有差异，但吉非替尼可选择性抑制A549细胞的DNA。PK的磷酸化不能抑制细胞的表达。MTT法检测细胞活力，发现细胞被DNA覆盖。用PK抑制剂刺激后，顺铂对吉非替尼和A549细胞的致敏作用消失，对细胞无作用。ras 基因状态没有影响。试验发现，顺铂联合吉非替尼在A549和A549细胞中EGFR/Akt/Erk/PTEN//的表达或激活没有差异，但吉非替尼可选择性抑制A549细胞的DNA。PK的磷酸化不能抑制细胞的表达。MTT法检测细胞活力，发现细胞被DNA覆盖。用PK抑制剂刺激后，顺铂对吉非替尼和A549细胞的致敏作用消失，对细胞无作用。PK的磷酸化不能抑制细胞的表达。MTT法检测细胞活力，发现细胞被DNA覆盖。用PK抑制剂刺激后，顺铂对吉非替尼和A549细胞的致敏作用消失，对细胞无作用。PK的磷酸化不能抑制细胞的表达。MTT法检测细胞活力，发现细胞被DNA覆盖。用PK抑制剂刺激后，顺铂对吉非替尼和A549细胞的致敏作用消失，对细胞无作用。

免疫共沉淀法检测非小细胞肺癌中的EGFR和DNA。PK 与 A549 细胞中的 EGFR 和 DNA 相互作用。吉非替尼可以抑制PK的结合作用，但细胞不能。免疫荧光标记法表明，吉非替尼可以阻止A549细胞的EGFR进入细胞核和DNA。PK 结合，但对细胞没有这种影响。试验发现，吉非替尼可降低A549细胞核EGFR的表达，但对浙江大学博士论文中文摘要的细胞无影响。结论 吉非替尼联合顺铂可影响部分EGFR。TKI耐药的非小细胞肺癌具有协同抗肿瘤作用。吉非替尼联合顺铂的协同作用可能取决于吉非替尼对顺铂选择性致敏的作用。吉非替尼能阻止EGFR进入细胞核并抑制DNA吗？PK激活决定了吉非替尼和顺铂的组合是否有协同作用，而单一的EGFR或K。ras基因状态不足以筛选这部分有效人群。只有充分了解吉非替尼抑制EGFR进入细胞核的选择机制，才有可能找到能够预测联合治疗效果的筛选指标。本研究为探索含铂化疗联合EGFR-TKI筛查指标的有效性提供了新思路。关键词：非小细胞肺癌；EGFR-TKI 耐药；吉非替尼；顺铂；脱氧核糖核酸。PK; — 和：：：。—,-()%。,, sdr 锄头。-，，。. . 矿石，FR-，血液。-，。, Rm,, EGFR。切-，-ve。，。EGFR-d,,-TKI。，。， C。 ：（，）。----3ofK-ras。--, (G12S) of K--，离子，)。()--拉斯。/，。/. (u-．ns(CI1)．，ns(CI>1)tic(CI)