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几项研究分析了在第一代和第二代EGFR抑制剂耐药后，接受oxitinib 9291治疗的患者的耐药性。结果表明，奥昔替尼的耐药机制很少依赖于EGFR途径，仅有15%~32%的患者存在3个依赖于EGFR途径的EGFR突变，且多发生在EGFR C797位点，即奥昔替尼与EGFR的结合位点。
另外三个EGFR突变是G724、L792、L718和G719，它们似乎阻碍了奥昔替尼和EGFR的结合，导致耐药性。二线奥昔替尼的耐药机制多为非靶向机制介导，与HER受体酪氨酸激酶家族密切相关，包括MET扩增(激活下游HER3)(6%~26%)、EGFR(0%~36%)和HER2(0%~8%)。
有趣的是，还发现了奥昔替尼9291获得性耐药的其他机制，如ALK融合、brav600e突变、HER2插入、KRAS突变、NTRK融合、FGFR融合、RET融合和MET外显子14突变。
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