蛋白在制备肝癌预后评估及索拉菲尼疗效的生物标记物来

蛋白质在制备肝癌预后评估及索拉非尼疗效预测试剂盒中的应用

技术领域

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及蛋白质作为蛋白质分子标志物在制备肝癌预后评估和索拉非尼疗效预测试剂盒中的新应用。

背景技术：

2.肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新增病例78.20,000例，死亡74.50,000例。我国新增病例和死亡人数占一半以上，肝癌已成为我国第二大癌症死亡原因。

3.肝癌预后判断是控制肝癌复发转移的关键。近年来，研究发现了一些可能预测肝癌预后的分子，但这些指标的敏感性和特异性仍难以满足临床预测的要求。近年来，分子靶向药物在肝癌治疗中的应用研究逐渐受到关注，正在成为新的热点。多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼（）是目前唯一获得FDA批准用于肝癌分子靶向治疗的药物，但近期研究发现索拉非尼在患者中的反应率较低，只有少数患者可以真正受益。相当多的患者服用索拉非尼不仅没有效果，而且有严重的副作用。寻找能够有效预测索拉非尼疗效的生物标志物，指导索拉非尼临床应用，是一个亟待解决的问题。

4.因此，寻找能够预测肝癌预后的标志物成为亟待解决的问题。可预测肝癌术后复发中索拉非尼辅助治疗靶点的相关基因或蛋白。肝细胞癌及指导索拉非尼的临床应用具有重要意义。

5.foxa 基因家族由三个成员组成， 和 ，它们是包含结构域的肝核转录因子 (tor, hnf) 基因家族，分别编码 hnf-3α、β 和 γ 蛋白。它在早期胚胎内胚层中表达，在肝脏和胰腺的基因表达调控中起重要作用。在foxa家族中，在许多文献中均有报道，在肝癌、胃癌等恶性肿瘤中发挥重要作用。其在肝再生过程中发挥重要作用已被多次报道，近年来在成纤维细胞制备人诱导肝细胞的研究中发挥了重要作用。

6.作为一种重要的肝脏转录因子，以往的研究发现它在肝脏再生、肝细胞样细胞成纤维细胞的诱导等方面发挥着重要作用，同时还参与肝脏代谢，并其在肝癌中的表达及生物学效应尚未见文献报道。在肝癌组织中的表达，以及其低表达与患者生存和预后的关系，目前尚未见报道。在术后复发并接受索拉非尼治疗的患者中，与低表达 HCC 的患者相比，高表达患者的总生存期是否更长尚未见报道。

7.目前还没有关于蛋白质在制备肝癌预后评估和索拉非尼疗效预测试剂盒中的应用研究报告。

技术实施要素：

8.本发明的目的是提供该蛋白的新应用，特别是在制备肝癌预后评估和sora

Fini 响应预测工具包的应用。

9.本发明的第一方面提供了该蛋白在制备用于评估肝癌预后的试剂或试剂盒中的用途。

10.该技术发明人经过深入系统研究，首次发现利用免疫组化方法检测肝癌组织中蛋白质的相对表达量，可以判断肝癌的复发风险和生存率。肝癌患者；并发现，在接受索拉非尼治疗的肝癌术后复发患者中，高表达患者与低表达患者相比，总生存期更长。基于该蛋白相对表达量与肝癌预后的相关性，以该蛋白为分子标志物检测其表达量，可用于指导肝癌的预后判断，指导索拉非尼治疗的疗效。肝癌术后复发的预测。

11.本发明提供了该蛋白在制备评估肝癌预后的试剂盒中的应用。本应用是指以蛋白质为分子标记物，使用单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化试剂，检测肝癌组织中蛋白质的相对表达量；并进一步检测肝癌术后复发和接受索拉非尼治疗的患者肝癌组织的表达情况，分析低表达和高表达患者的总生存期。

12.进一步，试剂或试剂盒蛋白在肝癌组织中的相对表达水平。

13.进一步，该试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测肝癌组织中蛋白质的相对表达量，从而判断肝癌患者的复发风险和生存状况。

14.进一步，应用是指以蛋白质为分子标志物，利用单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化试剂，检测肝癌组织中蛋白质的相对表达量，从而确定肝癌患者的复发风险和生存状况可以预测肝癌患者的预后。

15.再者，多克隆抗体为商品化抗体，如兔多克隆抗体（公司，产品编号）。

16.进一步，免疫组化试剂包括二甲苯、乙醇、3%h2o2溶液、1%bsa封闭液、dab显色剂、苏木精和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg。

大多数肝癌组织中17.蛋白的表达明显低于相应的癌旁组织。当免疫组化评分高于或等于2时，蛋白高表达，低于2时，蛋白低表达。免疫组化检测蛋白表达可预测肝细胞癌患者的总体生存预后。预后较差。

18.本发明第二方面提供了该蛋白在制备用于预测索拉非尼治疗对肝癌患者术后复发效果的试剂或试剂盒中的用途。

19.本发明第三方面提供了该蛋白在制备用于指导肝癌患者术后复发索拉非尼给药的试剂或试剂盒中的应用。

20.当免疫组化评分低于2分时，肝癌患者术后总生存期较差，索拉非尼对肝癌术后复发患者的疗效也较差。在接受索拉非尼治疗的肝癌术后复发患者中，当免疫组化评分低于2分时，患者的总生存期较短。

21.检测肝癌组织中蛋白表达的方法包括以下步骤：

22.(1)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烘箱过夜；

23.(2)切片脱蜡成水；

24.(二甲苯

①

→

二甲苯

②

→

二甲苯

③

→

100% 乙醇 5 分钟

→

95% 乙醇 5 分钟

→

85% 乙醇 5 分钟

→

75% 乙醇 5 分钟

→

双蒸水5分钟）

25.(3)3% h2o2甲醇溶液，室温放置；

26.(4)双蒸5min

×

3；

27.(5)抗原提取：切片放入0.01m柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)，煮沸5分钟，停火，煮沸5分钟；

28.(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5分钟

×

3；

29.(7)1% bsa 封闭, 37℃;

30.(8)脱掉封闭液，不洗，直接加入一抗（上述兔多克隆抗体，稀释比1:100)。放在潮湿的地方盒，37℃，然后在4℃冷藏16小时过夜；

31.(9)4℃取出，室温复温，用0.01m pbs洗涤5min

×

4；

32.（10)滴加二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg，购自丹麦Dako，即用型，无需稀释），37℃ ;

33.(11)0.01m pbs 洗涤 5min

×

4、轻拍颜色2-，显微镜下观察；

34.(12)双蒸水停止显色，苏木素复染10秒；

35.(13)分化后自来水回蓝，用蒸馏水浸泡；

36.(14)脱水透明，盖上盖玻片；

37.(15)显微镜下观察阳性染色，分别在肝癌组织和癌旁组织中随机选取3个视野，拍照；

38.(16)用（公司）软件对组织样本进行扫描。扫描后病理学家根据核阳性率按以下标准进行免疫组化评分：“0” （负）“0.5”（正≤20%），“1”（20%≤正≤35%），“1.5”（35%≤正≤50%），“ 2”（50%≤阳性≤65%）、“2.5”（65%≤阳性≤80%）、“3”（80%≤阳性≤90%）或“3.5 ”（90%≤阳性≤100%）。肝细胞癌组织染色评分<2表示低表达，组织染色评分≥2表示高表达。

39.本发明第四方面提供了该蛋白在制备用于评估肝癌预后和预测索拉非尼疗效的试剂盒中的应用。

40.本发明还提供了该蛋白表达检测试剂在制备用于评估肝癌预后和预测索拉非尼疗效的试剂盒中的应用。

4本发明第五方面提供了一种评估肝癌预后和预测索拉非尼疗效的试剂盒，其中该试剂盒包括检测肝癌组织中蛋白质相对表达水平的试剂。

42.进一步，该试剂盒包括：单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂。

43.进一步免疫组化试剂包括二甲苯、乙醇、3%h2o2溶液、1%bsa封闭液、dab显色剂、苏木精和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg。

44.本发明的优点是：

45.1、本发明利用蛋白质作为蛋白质分子标志物判断肝癌患者术后生存预后，以及索拉非尼对肝癌患者术后复发的疗效，预测肝术后生存率癌症患者和肝癌患者。术后复发患者是否使用索拉非尼具有重要的指导意义。

46.2、本发明蛋白与肝癌预后相关性的发现，为评估肝癌术后复发风险和患者生存率提供了可靠依据，对肝癌患者的预后判断具有重要作用。对肝癌患者的术后监测和序贯治疗也具有重要的指导意义。当免疫组化评分低于2分时，肝癌易复发，患者术后生存时间较短。同时发现，在肝癌术后复发并接受索拉非尼治疗的患者中，当

免疫组化评分低于 2 分的患者总生存期较短。

图纸说明

47.图1为肝癌组织免疫组化染色图。可见，多克隆抗体可以特异性识别肝癌组织中的蛋白质。（左图为邻近组织，右图为配对肝癌组织）

48.图2为156例患者肝癌组织及配对癌旁组织中表达水平的免疫组化染色。可以看出，在肝癌组织中表达水平较低。

49.图3显示了根据肝癌患者的表达水平对肝癌患者进行分组并对患者预后进行生存分析的结果。可见，低表达的患者预后相对较差。（A图为总生存期，b图为无瘤生存期）

50.图4为肝癌组织免疫组化染色结果。可以看出肿瘤组织中的染色比较弱，染色评分<2分表示低表达。随访发现该患者预后不良。

51.图5为肝癌组织免疫组化染色结果。可以看出，肿瘤组织中的染色比较弱。

52.图6为肝癌组织免疫组化染色结果。可见肿瘤组织中染色比较强，染色评分≥2表示高表达。随访发现患者预后良好。

53.图7为肝癌组织免疫组化染色结果。可见肿瘤组织中染色比较强，染色评分≥2表示高表达。随访发现患者预后良好。

54.图8是肝癌术后复发患者按表达水平分组并接受索拉非尼治疗的结果，以及患者预后的生存分析结果。治疗效果更差。

55.图9为接受索拉非尼治疗的肝癌术后复发患者肝癌组织免疫组化染色结果。可见肿瘤组织中染色比较强，染色评分≥2表示高表达，随访发现患者预后良好。

56.图10为接受索拉非尼治疗的肝癌术后复发患者肝癌组织的免疫组化染色结果。可见肿瘤组织中的染色比较弱，染色评分<2分为低。表达、随访发现患者预后较差。

57.图11为接受索拉非尼治疗的肝癌术后复发患者肝癌组织的免疫组化染色结果。可见肿瘤组织中染色比较强，染色评分≥2表示高表达，随访发现患者预后良好。

58.图12显示了接受索拉非尼治疗的肝癌术后复发患者肝癌组织的免疫组化染色结果。可见肿瘤组织中的染色比较弱，染色评分<2分为低。表达、随访发现患者预后较差。

详细说明

59.下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式进行详细说明。

60.以下实施例中，肝癌患者的肿瘤组织切片均取自东方肝胆外科医院，经两位病理学家诊断为肝细胞癌。

61.示例1

62.本发明采用免疫组化方法检测肝癌组织中蛋白的相对表达量，具体步骤为：

63.(1)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烘箱过夜；

64.(2)切片脱蜡成水；

65.(二甲苯

①

→

二甲苯

②

→

二甲苯

③

→

100% 乙醇 5 分钟

→

95% 乙醇 5 分钟

→

85% 乙醇 5 分钟

→

75% 乙醇 5 分钟

→

双蒸水5分钟）

66.(3)3% h2o2甲醇溶液，室温放置；

67.(4)双蒸5min

×

3；

68.(5)抗原修复：切片放入0.01m柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)，煮沸5分钟，停火，煮沸5分钟；

69.(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5分钟

×

3；

70.(7)1% bsa 封闭, 37℃;

71.(8) 甩掉封闭液，不洗，直接加入一抗(1:100)。放入湿盒中，37℃，4℃冰箱过夜16小时；

72.(9)4℃取出，室温复温，然后用0.01m pbs洗涤5min

×

4；

73.(10)滴加dako二抗，37℃；

74.(11)0.01m pbs 洗涤 5min

×

4、轻拍颜色2-，显微镜下观察；

75.(12)双蒸水停止显色，苏木素复染10秒；

76.(13)分化后自来水回蓝，用蒸馏水浸泡；

77.(14)脱水透明，盖上盖玻片；

78.(15)显微镜下观察阳性染色，分别在肝癌组织和癌旁组织中随机选取3个视野，拍照；

79.(16)用（公司）软件对组织样本进行扫描。扫描后病理学家根据核阳性率按以下标准进行免疫组化评分：“0” （负）“0.5”（正≤20%），“1”（20%≤正≤35%），“1.5”（35%≤正≤50%），“ 2”（50%≤阳性≤65%）、“2.5”（65%≤阳性≤80%）、“3”（80%≤阳性≤90%）或“3.5 ”（90%≤阳性≤100%）。即获得组织的免疫组化评分，用于后续分析。

80.随机选取2例手术切除肿瘤组织的肝癌患者，采用上述免疫组化方法检测肝癌组织中的蛋白表达。结果表明，该多克隆抗体可以特异性识别肝癌组织中的蛋白质，如图1所示。

81.示例 2

82.采用上述免疫组化方法检测156例肝癌组织及相应癌旁组织的蛋白表达。结果显示，大多数肝癌的蛋白表达明显低于相应的邻近组织（p0.001)，见图2。

83.示例 3

84.以上156例患者按表达水平分为两组（免疫组化评分≥2分时高表达，低于2分时低表达），结合术后随访资料进行生存分析，绘制4年生存曲线（见图3)）。结果显示，肿瘤中低表达患者的术后总生存期和无瘤生存期明显短于高表达患者。

85.示例 4：

86.样本：肝细胞癌患者的组织切片，通过上述免疫组织化学方法的测试程序进行检查。

测定肝癌组织中蛋白质的表达。肝癌组织显微照片见图4。经计算，该组织的免疫组化评分为0分，低于2分。

87.术后随访显示，患者术后7个月死亡，无瘤生存时间仅为7个月，预后较差。

88.示例 5：

89.样品：肝细胞癌患者的组织切片，通过上述免疫组化法检测步骤检测肝细胞癌组织中蛋白的表达。肝癌组织显微照片如图5所示，经计算，该组织的免疫组化评分为0分，低于2分。

90.术后随访显示，患者术后3.5个月死亡，无瘤生存时间仅为3.5个月，预后较差。

91.示例 6：

92.样本：肝细胞癌患者的组织切片。采用上述免疫组化方法检测肝细胞癌组织中蛋白的表达。肝癌组织显微镜照片见图6。经计算，该组织的免疫组化评分为3分，高于2分。

93.术后随访显示，患者总生存时间60个月以上，术后60个月未发现转移和复发，预后良好。

94.示例 7：

95.样品：肝细胞癌患者的组织切片，通过上述免疫组化法检测步骤检测肝细胞癌组织中蛋白的表达。肝癌组织的显微照片如图7所示，计算后该组织的免疫组化评分为2分，等于2分。

96.术后随访显示，患者总生存时间超过60个月，术后60个月未发现转移和复发，预后良好。

97.示例 8：

98.对85例术后复发并接受索拉非尼治疗的肝癌患者的肿瘤组织按肝癌组织水平进行分类（免疫组化评分≥2分时高表达，评分低于2时为低表达）并分为两组，结合术后随访资料进行生存分析，绘制4年生存曲线图（见图8)）。结果表明，肿瘤中低表达的肝癌术后复发，接受索拉非尼治疗的患者总生存期明显短于高表达患者。

99.示例 9：

100.样本：接受索拉非尼治疗的肝癌术后复发患者的肿瘤组织切片。上述免疫组化方法用于检测肝癌组织中蛋白的表达。肝癌组织显微照片见图8。经计算，该组织的免疫组化评分为3分，高于2分。

101. 根据术后随访，患者术后复发后总生存时间40个月以上，预后良好。

102.示例 10：

103.样本：手术后复发并接受索拉非尼治疗的肝癌患者的肿瘤组织切片。采用上述免疫组化方法检测肝癌组织中的蛋白表达。肝癌组织显微照片见图9。经计算，该组织的免疫组化评分为1分，低于2分。

104.术后随访，患者术后复发后总生存时间为6个月，预后较差。

105.示例 11：

106.样本：接受索拉非尼治疗的肝癌术后复发患者的肿瘤组织切片。采用上述免疫组化方法检测肝癌组织中蛋白的表达。肝癌组织的显微照片显示在图1中。11. 经计算，组织免疫组化评分为3分，高于2分。

107.术后随访，患者术后复发后总生存时间超过38个月，预后良好。

108.示例 12：

109.样本：接受索拉非尼治疗的肝癌术后复发患者的肿瘤组织切片。采用上述免疫组化方法检测肝癌组织中的蛋白表达。肝癌组织的显微照片显示在图1中。12. 经计算，该组织的免疫组化评分为1分，低于2分。

110.根据术后随访，患者术后复发后总生存时间为4个月，预后较差。

111.从以上实验结果可以看出，免疫组化检测蛋白表达可以预测肝细胞癌患者术后的总体生存预后，可用于术后患者索拉非尼的治疗。肝癌复发。初步预测效果。当免疫组化评分低于2分时，肝癌患者的总生存期较差，索拉非尼对肝癌术后复发患者的疗效也较差。显然，蛋白质与术后肝细胞癌，以及接受索拉非尼治疗的患者肝细胞癌术后复发之间存在一定的相关性。所以，以蛋白质为蛋白质分子标记物检测其表达可预测术后肝细胞癌的发生。肝癌患者术后复发可预测患者的生存预后，以及索拉非尼治疗的效果。相应地，本领域技术人员显而易见的是，特异性抗蛋白抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，可用于制备确定肝癌手术预后的制剂或试剂盒。

112. 以上对本发明的优选实施例进行了具体描述，但本发明并不限于这些实施例，本领域的技术人员还可以进行各种等效的修改或替换，例如检测到dna、mRNA水平等，这些等价的修改或替换都包含在技术权利要求所定义的范围内。