抗体药物的药物代谢(详见贝伐珠单抗)的检测手段

一种识别贝伐单抗的单克隆抗体及其应用

技术

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种识别贝伐单抗的单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 近年来，抗体药物以其安全、有效、特异性高的特点，被广泛应用于肿瘤、移植排斥、感染性疾病、自身免疫性疾病等疾病的临床治疗。抗体药物的药物代谢是临床前和临床试验研究中的重要检测指标。

[0003]贝伐单抗是以血管内皮生长因子（ial ，VEGF）为特异性靶点的重组人源化IgG1型单克隆抗体，可特异性结合VEGF，阻断VEGF与VEGF受体的结合和信号转导1和2，抑制VEGF的生物学活性，阻断血管生成，从而无法提供肿瘤组织生长所需的氧气等营养物质，发挥抗癌作用，贝伐单抗单克隆抗体可用于治疗转移性结直肠癌，非小细胞肺癌和乳腺癌。

[0004]由于贝伐单抗的靶标VEGF是一种可溶性蛋白，其研发机构在该药物的药物代谢()研究中采用了检测血清总药物浓度的方法，不区分游离药物和与目标VEGF结合的药物（详见贝伐单抗产品说明），因此需要检测试剂来鉴别游离贝伐单抗和已与VEGF结合的贝伐单抗。 （）使用说明书中对PK检测的描述明确指出，在检测血液中的药物浓度时，应包括游离药物和配体结合药物。但国内常用的检测方法主要是抗原VEGF包被板检测，不能检测与VEGF结合的贝伐单抗，也不能同时检测游离药物和配体结合药物。因此，不能用于临床检测。反映生物样品中的总药物含量。

[0005]综上所述，研发出一种可有效检测血液中贝伐单抗浓度的单克隆抗体，可同时检测游离药物和配体结合药物，在临床前和临床试验中检测贝伐单抗。 的血药浓度为临床试验的生物学分析提供了强有力的工具，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足和实际需要，本发明提供了一种识别贝伐单抗的单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可以与抗贝伐单抗联合，作为监测和检测工具。评价药物代谢过程，对贝伐单抗药物代谢的临床分析具有重要意义。

[0007] 为此，本发明采用以下技术方案：

[0008]在第一方面，本发明提供了一种识别贝伐单抗的单克隆抗体，该单克隆抗体轻链001的氨基酸序列为3.010.3，轻链001的氨基酸序列为« 2为8.010.4，轻链001«的氨基酸序列为SEQ ID N0.5；

所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，重链CDR2的氨基酸序列为5£010来自).8。

[0010]单克隆抗体Fab片段的轻链氨基酸序列为SEQ ID N0.1，单克隆抗体Fab片段的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

[0011] 所述的SEQ ID NO.1如下：

[0012].

[0013] 所述的SEQ ID NO.2如下：

[0014].

[0015] 所述的SEQ ID NO.3如下：

[0016].

[0017] 所述的SEQ ID NO.4如下：

[0018].

[0019] 所述的SEQ ID NO.5如下：

[0020].

[0021] 所述的SEQ ID NO.6如下：

[0022].

[0023] 所述的SEQ ID NO.7如下：

[0024].

[0025] 所述的SEQ ID NO.8如下：

[0026].

[0027] 在本发明中，发明人通过对现有技术中贝伐单抗药物浓度检测的优缺点进行深入研究，通过设计大量复杂的实验，反复筛选，最终发现上述单克隆抗体，验证该抗体可特异性识别贝伐单抗，而不影响贝伐单抗与VEGF的结合。药物代谢是临床评价药物在体内作用的重要手段，对给药方式和剂量具有重要意义。因此，抗体药物浓度的准确检测关系到临床用药的效果。本发明提供的与抗贝伐单抗特异性结合的抗体可以作为监测和评价贝伐单抗药物代谢过程的工具。对分析贝伐单抗的药物代谢有重要作用。

[0028] 本发明提供的单克隆抗体命名为5A9，是一种以贝伐单抗为免疫原，采用单克隆抗体技术制备的特异性抗贝伐单抗单克隆抗体。单克隆抗体的序列不同于现有的序列，具有新颖性和创造性。

[0029] 贝伐单抗包括 ( ) 及其生物类似药。

[0030] 在第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，其分泌第一方面的单克隆抗体。

[0031] 第三方面，本发明提供了第一方面所述的单克隆抗体或第二方面所述的杂交瘤细胞，用于制备评价贝伐单抗代谢过程的药物和/或用途套件。

[0032] 在第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

[0033]（1)动物免疫；

[0034]（2)细胞融合；

[0035] (3)杂交瘤细胞筛选；

[0036] (4)杂交瘤细胞的克隆；

[0037] (5)单克隆抗体的制备。

[0038] 作为一种优选的技术方案，如第一方面所述的一种单克隆抗体的制备方法，具体包括如下步骤：

[0039]（1)动物免疫：使用6周龄BALB/C雌性小鼠，抗原为商品化贝伐单抗，免疫途径为皮下注射；

[0040](2)细胞融合：制备脾细胞悬液、骨髓瘤细胞悬液和饲养层细胞，采用PEG介导的融合方法进行融合；

[0041]（3)杂交瘤细胞的筛选：常规间接法筛选步骤（2)得到的融合细胞的阳性孔；

[0042](4)杂交瘤细胞的克隆：将步骤(3)筛选出的阳性孔通过常规有限稀释法克隆得到单克隆抗体细胞系5A9细胞；

[0042]p>

[0043](5)单克隆抗体的制备：将步骤(4)得到的5A9细胞扩增培养，注入小鼠腹腔，收集腹水，离心取上清，纯化得到单克隆抗体。

[0044] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0045] 本发明提供的单克隆抗体可特异性识别，与其他IgGl型抗体无交叉反应，不阻断贝伐单抗与VEGF的结合，无中和能力，可监测和评价贝伐单抗的代谢过程具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

图纸说明

[0046] 图。附图说明图1为本发明单克隆抗体5A9与贝伐单抗结合特异性结果图；

[0047] 图。图2为本发明单克隆抗体5A9对的中和活性结果图。

具体实现方法

[0048] 为进一步说明本发明所采用的技术手段及其效果，下面结合附图并通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明是不限于实施例的范围。

[0049] 实施例1的单克隆抗体5A9的制备方法

本实施例的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、杂交瘤细胞克隆、单克隆抗体制备等。

[0051](1)动物免疫：使用6周龄BALB/C雌性小鼠，抗原商品化 。采用常规免疫方法，免疫途径为皮下注射50μg与弗氏完全佐剂等体积混合，在小鼠背部3～4点皮下注射；两周后进行两次相同剂量的免疫，用弗氏不完全佐剂；两周后进行3次免疫，弗氏不完全佐剂；两周后加强免疫，弗氏不完全佐剂；3天后取脾细胞融合；(2)细胞融合：末次免疫后第三天制备；_

[0053] 脾细胞悬液的制备：细胞融合当天制备，取免疫BALB/c小鼠，摘除眼球采血，分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清, 颈脱位致死小鼠, 取脾制备脾细胞悬液;

[0054]骨髓瘤细胞悬液的制备：提前两周回收细胞，确保使用时细胞处于对数生长期； [0055] 饲养细胞的制备：提前两天获得小鼠腹腔巨噬细胞，加入96孔板培养；

[0056] 细胞融合：采用PEG介导的融合方法，取脾细胞和骨髓瘤细胞按5:1的比例混合在无血清DMEM培养基中，离心5分钟，取出上层振离心管用力打散细胞，1分钟内加入1 mL 50% PEG (pH S 0, 40°C)使细胞融合，边加入边摇晃，加入后静置90秒，加入无血清终止DMEM培养基融合，1500 OrPm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到含有饲养细胞的96孔细胞板中，37℃，5%细胞培养箱中培养二氧化碳；

[0057]（3)杂交瘤筛查

[0058]细胞培养箱培养5天后，换一次HAT培养基，第10天换HT培养基。当融合细胞覆盖孔底10%-50%时，采用常规间接法。筛选阳性孔。用包被板检测杂交瘤细胞培养上清，二抗为酶标山羊抗鼠抗体，以鼠抗血清作为阳性对照，筛选出抗体高表达的杂交瘤细胞;

[0059] (4)杂交瘤细胞的克隆

[0060] 筛选出的特异性强的阳性孔，通过常规有限稀释法克隆得到单克隆抗体细胞系5A9细胞； [0061] 从原始孔中获得的阳性杂交瘤细胞可能来源于两个或多个杂交瘤细胞分泌的抗体是异质的。为了获得完全均一的单克隆抗体，必须克隆杂交瘤细胞； [0062] 为制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，使用 2 含 0% 血清的 HT 培养基稀释至每毫升 8 个细胞，并将小鼠腹膜细胞以每毫升 5E4 个细胞加入到杂交瘤细胞悬液中。每孔接种0.1mL细胞悬液，即每孔含0.8个杂交瘤细胞； 37℃，5%CO2加湿培养7-10天，肉眼可见的克隆可检测到抗体；倒置显微镜下观察，标记只有单个克隆生长的孔，取上清进行抗体检测； [0063] 取抗体检测阳性孔中的细胞进行扩增培养，冷冻后，进一步检测阳性孔中的细胞。通过鉴定克隆的单克隆抗体，筛选出阳性克隆细胞株5A9；

[0064] (5)抗体的制备

[0065] 将选定的杂交瘤细胞扩增培养，取6周龄左右的小鼠，腹腔注射石蜡油0.5mL。一周后，2E6 杂交瘤细胞被腹腔注射。小鼠腹部明显变大，收集腹水，离心上清液得到单克隆抗体腹水。抗体经A吸附柱纯化，得到纯化的单克隆抗体5A9细胞。

[0066]单克隆抗体5A9的氨基酸序列

[0067] 以下是单克隆抗体5A9轻链和重链可变区的序列，轻链可变区的序列和已知序列如下，可变区的序列重链区域，序列比对结果如下，与现有序列不同，具有特异性； [0068] Fab轻链氨基酸序列：108个氨基酸

[0069] SEQ ID N0.1:

[0070]

[0071]话单区域信息如下

[0072] CDR1:27-ID N0.3 是

[0073] CDR2:53-ID N0.4 是

[0074] CDR3:78-ID N0.5 是

[0075] Fab重链氨基酸序列：132个氨基酸

[0076]SEQ ID NO.2:

[0077] NRRP

[0078]话单区域信息如下

[0079] CDR1:23-37:..

[0080] CDR2:50-67:SEQ ID NO_7 是。

[0081] CDR3:87-106: SEQ ID N0.8 是。

[0082]实施例2评价单克隆抗体5A9与贝伐单抗结合的特异性[0083]实验步骤

[0084] (1)包被：分别用包被缓冲液和对照抗体稀释至5 μg/mL，分别加入不同的96孔板，100 mL/孔，2-8℃过夜；

[0085] (2)洗板：用洗涤液洗板3次，/孔；

[0086]（3)块：/孔 0 • 1% BSA 溶液，室温 2.5 小时；

[0087](4)洗板：用洗涤液洗板3次，/孔；

[0088] 样品稀释：用缓冲液稀释5A9抗体，然后连续稀释2次，得到12个浓度样品，分别为：/mL、/mL、/mL、50ng/mL、25ng/mL、1< @2.5ng/mL、6•25ng/mL、3•12ng/mL、1.56ng/mL、/mL、/mL^/mL；

[0089]⑹将稀释后的样品转移至96孔板，/孔；

[0090] (7)孵育：2-8°C孵育过夜；

[0091](8)洗板：用洗涤液洗板3次，/孔；

[0092](9)酶结合物：山羊抗鼠IgG Fc片段酶结合物IgG-HRP，用缓冲液1:8000稀释/孔，37℃孵育30分钟；

[0093](10)洗板：用洗涤液洗板3次，/孔；

[0094](11)底物：加入新鲜制备的底物，100个细胞/孔，37℃孵育6分钟；

[0095](12)终止：2M，50μL/孔；

[0096](13)测定：酶标仪读数，波长；

[0097](14)结果：使用了4参数方程，结果如图1所示；

[0098] 从图1可以看出，两种IgG1型治疗性单克隆抗体（和）用于包被板检测5A9识别的特异性，5A9只能结合，但不能识别，说明5A9可以特异性识别，与其他IgG1型抗体无交叉反应。

[0099] 实施例3的单克隆抗体5A9中和活性的评价 [0100] 实验步骤

[0101](1)板包被：将重组人VEGF抗原用包被液稀释至50ng/mL，加入板中，每孔100 μL，4℃孵育过夜；

[0102](2)洗盘：第二天取出盘子，倒空液体，用洗液洗三遍，拍干；

[0103](3)封闭：将每孔置于封闭液中，室温孵育2h；

[0104](4)洗板：倒空液体，用洗液洗3次，拍干残液；

[0105] (5)样品的稀释和上样：用缓冲液将抗体稀释至6ug/mL，然后连续稀释2次，得到12个浓度：/mL,/mL,/mL,/mL,187 • 5ng/mL, 93 • 8ng/mL, 46.88ng/mL, 23.4ng/mL, 11.72ng/mL, 5.86ng/mL, 2.93ng/mL,1.96ng/Ml，用缓冲液将抗体5A9稀释至20ug/mL，然后连续稀释2倍得到12个浓度：20 μg/mL、10 μg/mL、5μg /mL、2·5ug/mL、1·25μg/mL、/mL、312·5ng/mL、156·25ng/mL、78·12ng/mL、39·06ng/mL、19·63ng/mL和9.76ng/mL，然后将5A9各稀释梯度与等体积6 μg/mL混合，室温孵育2h；

[0106](6)去除封闭液，立即加入孵育后的混合样品，在标准曲线中，100 this/孔，室温孵育1.5h；

[0107]⑺洗板：清空液体，用300本洗剂洗3次，拍干残液；

[0108] (8)二抗：山羊抗人IgG Fc片段酶结合物IgG-HRP，用缓冲液1:稀释，100 this/孔，37℃孵育1 h；

p>

[0109]⑼洗板：清空液体，用洗液洗三遍，取一千余液；

[0110](10)底物：加入TMB显色液，每孔100 μL，室温避光放置10分钟；

[0111](11)终止：加入2M H SO ，每孔50 μL，终止反应；

[0112](12)读板：在酶标仪(0D)上读板并分析数据，结果如图2所示；

[0113] 如图2所示，随着5A9浓度的增加，贝伐单抗的浓度曲线并没有呈现下降趋势，说明5A9不能阻断贝伐单抗与VEGF的结合，没有中间体和能力。综上所述，本发明提供了一种识别贝伐单抗的单克隆抗体及其应用。通过大量复杂实验筛选验证，该单克隆抗体可特异性结合贝伐单抗，同时不影响贝伐单抗与VEGF的结合，可监测和评价贝伐单抗的代谢过程，从而具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

[0115] 申请人声明，本发明通过上述实施例说明了本发明的详细方法，但本发明不限于上述详细方法，即并不意味着本发明必须依靠上述详细方法来实施。本领域技术人员应当理解，对本发明的任何改进、对本发明产品各原料的等效替换、辅助成分的添加、具体方法的选择等，均在保护范围内。本发明的范围和公开范围。