肾癌起病隐匿,多发现较晚,

【摘要】 肾癌起病隐匿，多发现较晚。对于晚期患者，往往需要化疗以延缓患者的生存期。然而，肾癌对化疗极为不敏感，常规化疗方案效果较差。以索拉非尼为代表的靶向药物的出现，一度为肾癌化疗带来了希望。但随着研究的深入，发现索拉非尼治疗晚期肾癌的远期效果不佳，在其他肿瘤中也有应用。靶向治疗研究发现，不仅会伴随肿瘤耐药性的出现，还可能增加残留肿瘤的恶性程度。肿瘤干细胞学说认为，肿瘤干细胞（CSCs）的存在是肿瘤发生、发展、转移、复发和化疗耐药的根本原因。因此推测肾癌对靶向治疗产生耐药性的可能原因是肾癌中存在CSCs。由于肿瘤干细胞多处于GO期，化疗只对细胞分裂有效，化疗后存活的CSCs苏醒再次分化，导致化疗失败。识别 CSCs 的关键在于筛选可靠的标记。研究证实，CD34、、CD44等在其他肿瘤中均有不同程度的表达，可能与癌症干细胞密切相关；CSC干性特征的维持依赖于某些基因的表达，这些基因参与调控CSC的自我增殖、分化和耐药性，研究证实基因Oct3/4、Bmi1、β - 并且可能与癌症干细胞有不同程度的关系；研究表明，肿瘤中的侧群细胞（side ，SP）被认为是一种可能富含 CSCs 并能表现出强干细胞特性的细胞群。SP细胞的选择是基于细胞膜上转运蛋白的表达，不仅与SP细胞有关，还与各种肿瘤的耐药性有关，被证实可能是肿瘤干细胞标志物之一。并且研究证实基因Oct3/4、Bmi1、β-和可能与癌症干细胞有不同程度的相关性；研究表明，肿瘤中的侧群细胞（side ，SP）被认为是一种可能富含 CSCs 并能表现出强干细胞特性的细胞群。SP细胞的选择是基于细胞膜上转运蛋白的表达，不仅与SP细胞有关，还与各种肿瘤的耐药性有关，被证实可能是肿瘤干细胞标志物之一。并且研究证实基因Oct3/4、Bmi1、β-和可能与癌症干细胞有不同程度的相关性；研究表明，肿瘤中的侧群细胞（side ，SP）被认为是一种可能富含 CSCs 并能表现出强干细胞特性的细胞群。SP细胞的选择是基于细胞膜上转运蛋白的表达，不仅与SP细胞有关，还与各种肿瘤的耐药性有关，被证实可能是肿瘤干细胞标志物之一。

此外，缺氧环境可以促进蛋白质的表达，肿瘤缺氧微环境诱导的缺氧因素被认为与肿瘤的恶性程度和耐药性有关，可能参与干性的维持。癌症干细胞的特征。CSC在其他肿瘤中的研究较早，但肾癌干细胞的研究仍处于早期阶段。本研究采用FCM、Blot、免疫荧光、RT-qPCR等技术从细胞和动物实验水平检测肾癌细胞系786-0中多种可能的癌干细胞的表达情况，并分析靶点。药物索拉非尼对这些表达的影响。本课题的开展将有助于拓展肾癌干细胞研究，有助于探索肾癌对靶向治疗耐药的原因，为肾癌的诊断、预后和化疗提供新的思路和线索。第一章索拉非尼对肾癌细胞株786-0的体外抑制和细胞周期作用目的：评价靶向药物索拉非尼对肾癌细胞株786-0的体外抑制和促凋亡作用及其对细胞周期的影响. 方法：选取786-0肾癌细胞株进行回收培养。Sora在不同浓度2.5μM、5.0μM、7.5μM、10.0μM Fini作用于细胞系，采集不同时间点（0h、24h、 48 小时、72 小时、96 小时）、先用MTS检测细胞在不同时间点、不同浓度组的增殖情况，再用FCM检测细胞凋亡和细胞增殖情况。细胞周期变化。结果：1.细胞增殖试验结果：将不同浓度和时间组的细胞增殖活性试验转化为抑制率，多元因子设计数据方差分析和主效应分析结果的F值浓度和时间分别为：57.681、126.0，均为P0.01，差异明显；并且两者之间存在显着的交互作用（F=4.410,P0.01). 然后用FCM检测细胞凋亡和细胞增殖。细胞周期变化。结果：1.细胞增殖试验结果：将不同浓度和时间组的细胞增殖活性试验转化为抑制率，多元因子设计数据方差分析和主效应分析结果的F值浓度和时间分别为：57.681、126.0，均为P0.01，差异明显；并且两者之间存在显着的交互作用（F=4.410,P0.01). 然后用FCM检测细胞凋亡和细胞增殖。细胞周期变化。结果：1.细胞增殖试验结果：将不同浓度和时间组的细胞增殖活性试验转化为抑制率，多元因子设计数据方差分析和主效应分析结果的F值浓度和时间分别为：57.681、126.0，均为P0.01，差异明显；并且两者之间存在显着的交互作用（F=4.410,P0.01). 以及多元因子设计数据方差分析和浓度和时间主效应分析结果的F值分别为：57.681、126.0，均P< @0.01，区别很明显；并且两者之间存在显着的交互作用（F=4.410,P0.01). 以及多元因子设计数据方差分析和浓度和时间主效应分析结果的F值分别为：57.681、126.0，均P< @0.01，区别很明显；并且两者之间存在显着的交互作用（F=4.410,P0.01).

总体结果表明，索拉非尼对肾癌细胞株786-0的抑制作用随着作用时间的延长和作用浓度的增加而逐渐增强，10.0μM最强的抑制作用。2.细胞凋亡检测结果：FCM检测细胞凋亡，选择10.0μM为作用浓度，选择0h、24h、48h、72h、96h为时间组。比较各时间组总凋亡率与0h对照组。方差分析F=1893.68，P0.001，24h组与对照组差异无统计学意义（P0.05)，其他时间组与对照组有显着差异（P0.0< 可显着促进其凋亡，阻止其在G0/G1期停止分化，从而达到抑制肿瘤的目的；治疗后G0/G1期细胞比例增加可能与肾癌有关。与干细胞的存在有关。

第二章肿瘤干细胞标志物在肾癌细胞系786-O中的表达及索拉非尼对其表达的影响目的：探讨肿瘤干细胞相关分子标志物CD34、CD44、@的表达情况>肾脏CD24在癌细胞系786-O中表达，分析靶向药物索拉非尼对这些标志物表达的影响。方法：在细胞实验中，用FCM检测细胞系中肿瘤干细胞相关标志物CD44、CD24、CD34的表达，然后用10.0μM作为行动的集中。对786-0肾癌细胞进行干预，在不同时间点（0h、24h、48h、72h、96h）检测各种标志物的表达变化。然后，在BALB/C-NU小鼠中建立动物肿瘤发生模型。对照组6只，给药组6只。模型建立成功后，给药组小鼠连续灌胃索拉非尼，处死。对小鼠进行肿瘤治疗，采用免疫荧光法检测对照组和给药组肿瘤组织标本中上述标志物的表达情况。结果：1、细胞实验流检测：①各时间组表达阳性率较低，对照组0.55±0.05%，96小时组增加至< @4.14% ±0.15%。各时间组与0h对照组比较，方差分析F=291.585，P值0.001，24h组差异无统计学意义（P0.0<

差异不显着；1.075，P=0.419，差异不显着。2.免疫荧光动物实验结果：成瘤动物模型良好，药物中的肿瘤治疗组和对照组用免疫荧光法检测组织中CD34、CD44、CD24的表达，结果显示：，，CD34在对照组的肿瘤组织中表达较少组，但在治疗组的肿瘤组织中明显增加；而CD44、对照组和药物治疗组肿瘤组织中CD24的表达较高，两组间差异无统计学意义，与细胞实验结果一致。结论：,,

提示CD34可能是肾癌细胞系786-0的肿瘤干细胞标志物，而CD44、CD24不适合。第三章：肾癌细胞系786-O肿瘤干细胞相关基因的表达及索拉非尼对其表达的影响目的：检测肿瘤干细胞Oct3/4、Bmi1、的相关基因β-，在肾癌细胞系 786-0 中的表达，并探讨索拉非尼对这些基因表达的影响。方法：在第2章研究的基础上，本部分研究检测癌症干细胞相关基因Oct3/4、Bmi1、β-，并在每组中从两个方面：实验和动物体内实验。细胞和动物肿瘤组织样本的表达。在细胞实验中，采用RT-qPCR技术先检测细胞系中可疑干细胞的基因表达，然后用10.0 μM索拉非尼进行干预，不同时间组（0h、24h、48、72h、96h）每个基因表达的变化。对给药组和对照组动物致瘤药物干预实验获得的肿瘤组织标本重复上述检测。结果：1.细胞实验各基因检测结果：①24h、48h、72h、96h组Oct3/4基因mRNA相对表达量分别为：1.21±0.10、3.28±0.35、4.38±0.41、7.55 ±0.@ >36；②Bmi1基因在24h、48h、72h、96h的相对mRNA表达量如下： <

98±0.27、7 7.22±24.0。与对照组相比，独立样本t检验显示各基因给药组之间存在显着差异（P0.05)。结论：基因Oct3/4、β​​的表达程度不同-、Bmi1可在肾癌细胞系786-0中检测到，靶向药物索拉非尼可提高其表达水平，这提示肾癌细胞系786-0中可能存在极少量的癌干细胞、Oct3/4、β​​-、Bmi1基因可能是肾癌干细胞的相关基因。第四章：索拉非尼对肾癌细胞株786-SP细胞比例及HIF-1α和HIF-1α表达的影响 中的 HIF-2α：

方法：本部分研究在第三章研究的基础上，利用FCM检测786-0肾癌细胞中SP细胞的比例及索拉非尼不同时间后比例的变化。由于，HIF-1α、HIF-2α与SP细胞和肿瘤干细胞的比例有关，因此在体外细胞实验中，我们分别采用Blot和RT-qPCR技术分析了索拉非尼对不同时间组的影响。蛋白质和基因水平。对细胞进行HIF-1α、HIF-2α的蛋白质和基因检测。最后，为了验证上述细胞实验的结果，对动物致瘤模型药物干预实验中获得的对照组和药物组的肿瘤组织样本重复上述蛋白和基因水平。结果：1. SP细胞比例检测：对照组和24h、48h、72h、96h组SP细胞比例校正值分别为：1.06±0.05 %, 1. 21±0.12%, 2.66±0.28%, 14.05±1.52%, 4< @1.27±4.74%，各时间组与oh对照组比较，方差分析F=90.643，P0.001，24h组为与对照组无显着差异（P0.001）。0.05)、48h、72h、96h组与对照组有显着差异（P0.05)。2.细胞实验Blot结果： as 与 0h 对照组和 0h 对照组相比，蛋白质定量的内参，

@0.24、5.12±0.16；24、48h、72h、96h组HIF-1α基因mRNA相对表达量分别为：1.14±0.16、3.50± 0.28、7.53±0.27、10.67±0.75; HIF-2α基因在24h、48h、72h、96h的相对mRNA表达量分别为：1.29±0.15、6.39±0. 40、21.44±1.75、42.37±3.66。时间组与0h对照组比较，方差分析显示24h组比较差异不显着（P0.05)，48h、72h、96h组有显着性差异(P0.05).5. RT-qPCR 动物实验结果：对照组基因相对mRNA表达差异有显着性(P0.05))。和管理组，分别为：0.89±0.21、16.27±6.62；HIF-1α基因mRNA相对表达量 对照组和给药组分别为：0.98±0.35、9.60±3.29 ; HIF-2α基因mRNA相对表达量对照组和给药组剂量分别为：1.05±0.39、6.58±1. 49. HIF-1α基因mRNA相对表达量 对照组和给药组分别为：0.98±0.35、9.60±3.29 ; HIF-2α基因mRNA相对表达量对照组和给药组剂量分别为：1.05±0.39、6.58±1. 49. HIF-1α基因mRNA相对表达量 对照组和给药组分别为：0.98±0.35、9.60±3.29 ; HIF-2α基因mRNA相对表达量对照组和给药组剂量分别为：1.05±0.39、6.58±1. 49.

与对照组相比，独立样本的t检验显示各基因给药组之间存在显着差异（P0.05)结论：肾癌细胞系786中可检测到一小部分SP -0 在肾癌细胞系786-0中也可以不同程度地检测到HIF-1α和HIF-2α的表达，并且在索拉非尼治疗后表达水平升高，提示检测到的SP细胞可能是一个富含肾癌干细胞的细胞群，HIF-1α和HIF-2α的表达可能与肾癌细胞系786-O对索拉非尼的耐药性有关。