《正反馈环路促进肺腺癌细胞吉非替尼耐药的机制研究》

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1、 /MET正反馈回路促进肺腺癌细胞吉非替尼耐药机制研究类型学位一级学科（专业）生物医学工程二级学科（专业）生物医学工程研究方向分子生物学讲师罗尔平教授培训单位学校生物医学工程专业2016年5月分类号Q74 UDC 577 保密级别 我声明我秉承学校严谨的学风和优良的科学道德。我声明我提交的论文是我在导师指导下进行并获得的研究工作。研究结果。据我所知，除了文中

2、除标注和承认的地方外，论文不包含他人已发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人申请学位或用于其他目的的成果。与我一起工作的同志对这项研究的任何贡献都在论文中明确说明和承认。如论文申请及信息不准确，本人将承担一切相关责任。论文作者署名： 日期： 宝宝 保护 保护 知识 知识 知识产权 声明 声明 本人完全了解第四军医大学关于知识产权保护的规定，即：研究生 学校学位学习期间论文工作的知识产权单位为第四军医大学。本人保证，毕业离校后，发表论文和使用论文成果的第一签字单位仍为第四军医大学。学校可以发表全部或部分论文

3、内容（包括电子版，不包括机密内容），论文可以通过影印、微型化或其他复制方式保存；学校有权允许论文浏览和借阅，并在校园网提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将学位论文加入中国优秀博士、硕士论文全文数据库，编入中国知识资源通用数据库等，并可浏览下载。作者署名：导师署名：日期：第四军医大学博士论文目录缩略表1 中文摘要4 7 前言11 文献综述13 一、

4、 3. 靶向肿瘤血管生成的药物 17 4. MET靶向药物18 5. 二、 MET基因扩增是吉非替尼耐药的重要机制19 1. 吉非替尼抗肿瘤作用机制 19 2. 吉非替尼耐药机制 21 三、 是 一个与肿瘤耐药密切相关的转录因子 24 正文 28 Part 1 促进吉非替尼耐药在肺腺癌中的作用研究细胞 28 1 实验材料 29 1.1 主要仪器和设备 29 1.2 细胞系 29 1.3 初级试剂 29 1.4 初级缓冲液 30 2 实验方法 30 2.1 细胞培养 30 2.2 抗性细胞系的构建 31 2.3 构建稳定的上调和下调

肺腺癌细胞株5、32 2.4 MTT检测33 2.5 EdU检测33 第四军医大学博士论文2.6 细胞周期检测33 2.7 细胞凋亡检测34 2.8 统计分析34 3 实验结果34 3.1 构建肺腺癌细胞吉非替尼耐药稳定细胞系34 3.@ >2 可促进肺腺癌细胞对吉非替尼耐药35 3.3 可增强吉非替尼作用下肺腺癌细胞的 DNA 复制活性36 3.4 可以减弱吉非替尼对肺腺癌细胞 G1 期阻滞和促凋亡作用 37 4 讨论 40 第二部分 MET/AKT 信号通路激活机制研究肺腺癌细胞 43 1

6、实验材料44 1.1 主要设备44 1.2 实验动物44 1.3 细胞系44 1.4 主要试剂45 1.5 主要缓冲液46 2 实验方法 48 2.1 细胞培养 48 2.2 印迹 48 2.3 实时 PCR 50 2.4 免疫组织化学染色 54 2.5 ChIP 55 2. 6 萤光素酶报告基因60 2.7 荷瘤小鼠模型64 2.8 统计分析64 3 实验结果64 3.1 下调 pMET、MET 和pAKT 分子的表达水平显着降低64 3.@ >2 PHA-部分逆转MET信号通路的作用

上调7、65 3.3 转录激活肺腺癌细胞中的MET 66 3.4 下调降低体内肺腺癌细胞对吉非替尼的耐药性67 第四军医大学博士论文4 讨论69 第三部分 MET 激活肺腺癌细胞 AKT/信号通路的机制研究71 1 实验材料71 1.1 主要仪器71 1.2 细胞系72 1.3 组织标本72 1. 4 初级试剂73 1.5 初级缓冲液73 2 实验方法75 2.1 细胞培养75 2.2 构建稳定上调和MET下调的肺腺癌细胞系75 2.3 印迹76 2.4 实时 PCR 76

8、2.5 免疫组化染色77 2.6 统计分析77 3 实验结果77 3.1 稳定细胞系的构建77 3.2 MET 下调 显着降低和pAKT 表达水平78 3.3 LY- 可以部分逆转 MET 对 AKT/信号通路相关分子的上调78 3.4 MET 和 pAKT 在肺腺癌组织中的表达 正相关 79 4 讨论 81 总结 84 参考文献 85简历及研究成果 101 致谢 102 第四军医大学博士论文-1- 缩略语列表 缩略语列表 缩略语 英文全名 英文全名 中文全名 中文全名 AKT B 蛋白激酶

9、 B ALK 间变性淋巴瘤激酶 Amp ASCO of of ATP 三磷酸腺苷 bp 碱基对 碱基对 BSA 牛血清白蛋白 cDNA DNA 互补脱氧核糖核酸 ChIP 染色体共免疫沉淀 DEPC

10、焦碳酸二乙酯 DMSO 二甲基亚砜 DNA 酸 脱氧核糖核酸 EDTA 酸 乙二胺四乙酸 EGFR 表皮生长因子受体 EML4 echl-like 4 棘皮动物微管相关蛋白 4 FBS 胎牛血清 FCM 流式细胞仪 FGF g

11、成纤维细胞生长因子博士 第四军医大学论文-2-FLT3 fms-like 3 FMS-like 3 box M1 box M1 Her-2 -2 2 HGF hr hour hour like 1

12、r 胰岛素样生长因子 1 受体 IHC 免疫组化 kb 对千碱基对 kDa 千道尔顿 KIT 干细胞干细胞生长因子受体 MEK1 1 丝裂原活化蛋白激酶激酶 1 MET 肝细胞生长因子受体 min min mRNA RNA信使RNA k

13、 1型神经营养酪氨酸激酶1型受体MT型突变体OD光密度ORR率客观反应率OS总生存期PAGE凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS磷酸盐缓冲盐水第四军医大学博士论文-3-PCR聚合酶链反应生长因子

14、给予血小板衍生因子 PFS-free 无进展生存 PI3K 3-磷酸肌醇激酶 PMSF l 苯甲基磺酰氟 PVDF 聚偏二氟乙烯 rpm / rpm RT-PCR - 逆转录聚合酶链反应 SDS 硫磺

15、ate sec sec RNA RNA Tris N-Tris () Tris VEGF 血管内皮生长因子 WT 野生型 野生型 第四军医大学博士论文-4 - /MET 正反馈回路促进吉非替尼耐药在肺腺癌细胞中 正反馈回路促进肺腺癌细胞对吉非替尼的耐药机制 药物作用机制研究 博士生：张维维 导师：罗尔平教授 导师：李宇副教授，第四军医大学生物医学工程

16、西安学院基金项目：国家高技术研究发展计划() 吉非替尼耐药限制了其临床应用，其机制有待进一步研究。在近四分之一的 EGFR-TKI 耐药患者中检测到 MET 基因扩增。MET基因扩增已被证实通过修复反式激活介导的PI3K/AKT等信号通路获得吉非替尼耐药，这是吉非替尼耐药的重要机制。PI3K/AKT信号通路在肺癌细胞中常被过度激活，与肺癌的进展和EGFR-TKI耐药密切相关。

17、不是很清楚。此外，研究表明它受PI3K/AKT信号通路的调控。本研究探讨了吉非替尼耐药在肺腺癌中的作用，发现了与MET/AKT信号通路相互调控的分子机制。在肺腺癌细胞中，它可以与 MET DNA 启动子结合并在转录水平上调节 MET。MET 还可以通过激活 PI3K/AKT 信号通路来调节肺腺癌细胞中的转录因子。它与 MET 信号通路相互作用，形成正反馈回路，促进肺腺癌细胞对吉非替尼的耐药。我们还发现肺腺癌组织中MET和pAKT的表达远高于正常肺组织，

18、的表达呈正相关。本课题不仅阐明了肺腺癌细胞与MET/AKT信号通路相互调控的分子机制，也为肺腺癌的治疗提供了更丰富的理论依据。第四军医大学博士论文-5-第1部分：促进肺腺癌细胞吉非替尼耐药作用的研究 6个月后成功建立了吉非替尼耐药细胞株PC9/GR和/GR。MTT检测结果表明，上调可显着增强PC9和细胞对吉非替尼的耐药性，而下调可显着降低PC9/GR和HCC。

19、827/GR细胞对吉非替尼耐药。EdU检测结果显示，上调吉非替尼后EdU阳性细胞显着增加，而下调吉非替尼后EdU阳性细胞显着减少。此外，上调可以显着抑制吉非替尼对PC9和细胞的凋亡和G1期阻滞作用，而下调可以显着促进吉非替尼对PC9/GR和/GR细胞的凋亡和G1期阻滞作用。. 这些结果表明，吉非替尼在肺腺癌细胞耐药中起重要作用，可以减弱吉非替尼对肺腺癌细胞的凋亡和G1期阻滞作用。第二部分：肺腺癌细胞中 MET/AKT 信号的激活

2 0、通路的作用机制 我们采用 和实时荧光定量PCR技术观察肺腺癌细胞中相关分子在蛋白和mRNA水平的表达。我们发现肺腺癌吉非替尼耐药细胞系PC9/GR和/GR中pMET、MET和pAKT的表达远高于其亲代细胞系PC9和. 此外，PC9/GR 和 /GR 细胞的下调显着降低了 pMET、MET 和 pAKT 的蛋白表达水平，并降低了 MET 的 mRNA 表达水平。PC9 和细胞中的上调显着升高 pMET、MET 和

21、pAKT蛋白表达水平，并能增加MET的mRNA表达水平，但MET抑制剂PHA-有一定的逆转作用。为了进一步阐明 MET 调控的分子机制，我们使用 ChIP-PCR 方法发现转录因子可以与肺腺癌细胞 PC9 和 MET 中的 MET 的 DNA 启动子结合。荧光素酶报告基因检测结果表明，MET的DNA启动子活性在肺腺癌细胞PC9和PC9中显着增强。通过荷瘤小鼠模型，在体内进一步验证了促进肺腺癌细胞对吉非替尼耐药的作用以及对MET信号通路的调控。这些结果表明，在

22、肺腺癌细胞可在转录水平调控MET，调控其下游AKT信号通路。第三部分：肺腺癌细胞中 MET 激活 AKT/AKT 信号通路的机制 为了进一步阐明与 MET 信号通路的调控关系，我们考察了 MET/AKT 信号通路对在肺腺癌细胞中的作用。PC9/GR和/GR细胞中6-MET的下调可显着降低pMET、MET和pAKT的蛋白表达水平，并可降低mRNA表达水平。PC9和细胞中MET的上调显着增加了pMET、MET和pAKT的表达

23、蛋白表达水平，并可增加mRNA表达水平，但AKT抑制剂有一定的逆转作用。此外，我们还发现MET和pAKT在肺腺癌组织中的表达水平远高于相应的癌旁正常肺组织，并且这三种分子在肺腺癌组织中的表达呈正相关。这些结果表明MET/AKT信号通路可以在肺腺癌细胞中受到调控，MET/AKT信号通路相互调控形成正反馈回路。关键词: 肺腺癌, 吉非替尼, MET, AKT 第四军医大学博士论文-7-A loop和MET p

24、 肺博士: : 罗教授 : 李宇 , , 西安 : 高和

25、 of () a 在肺中。, 的不是。20-25% 的 EGFR-TKI 归因于 MET，一种基因

26、 为 . MET by - of PI3K, a to be to EGFR/ERBB . 像 MET 一样，也是

27、 在肺中，PI3K/AKT 和 EGFR-TKI 在肺中非常重要。那 , a - , 资源中的一个角色

28、 到 。, to 不是。第四军医大学博士论文-8-, 由PI3K/AKT. 在 中，我们的角色

29、 在肺到 ，和 MET/AKT 轴到 。我们对 MET 和 MET 在 . 我们也认为 MET PI3K/AKT 和环和 MET/AKT 在肺中起作用。