肿瘤多药产生凋亡机制的下调,细胞抗而逃避,

研究背景与目的：鼻咽癌是华南及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一。大多数患者被发现时已处于晚期。据资料显示，III-IV期患者约占总数的85%。放疗联合化疗是鼻咽癌治疗的主要方法，但总体治疗效果仍不理想。耐多药）。肿瘤多药耐药是指一种药物作用于肿瘤使其产生耐药后，肿瘤未接触过的多种结构不相关、机制不同的抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。肿瘤细胞耐药机制相当复杂，目前已知的有：（1)药物转运或摄取障碍；（2)药物活化障碍；（3)靶酶质量和数量）变化；（4)利用内部替代增加代谢途径；（5)增加分解代谢酶；（6)增加修复机制；（7)由于特殊的膜糖蛋白MDR-1的增加导致更多的药物从细胞中排出；（8)DNA链间或链内交联减少。MDR-1基因和该基因编码的P-gp糖蛋白目前研究最多，但根据上述机制研究中的相应药物并不能有效解决肿瘤细胞耐药问题，最新观点认为，肿瘤耐药的本质是细胞凋亡机制的下调。多种因素，细胞抗凋亡，逃避杀伤。寻找促进细胞凋亡的方法耐药肿瘤细胞的凋亡。抗肿瘤血管治疗是目前抗肿瘤治疗的热点。研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）在大多数人类肿瘤中的表达上调，血管内皮生长因子可以特异性作用于内皮细胞，刺激新生血管的形成，影响其生长、转移和转移。肿瘤预后。

贝伐单抗是一种针对VEGF的人源化单克隆抗体，2004年获FDA批准用于晚期结直肠癌一线治疗，2007年进入晚期头颈癌一线治疗。观察到单独使用贝伐单抗没有明显的抗肿瘤活性，对部分耐药复发/转移的患者联合化疗后甚至有效。有理由认为，贝伐单抗的抗肿瘤作用不仅能抑制肿瘤血管生成，还能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，这很可能是通过促进其凋亡来实现的。本实验的目的是：1.研究人鼻咽癌顺铂耐药细胞株CNE2/DDP的生物学特性。 2.在携带 CNE2/DDP 的裸鼠中建立皮下肿瘤模型。 3.在细胞和动物水平上研究了贝伐单抗对CNE2/DDP细胞凋亡的影响。研究方法：1.人鼻咽癌低分化细胞株CNE2及其耐药细胞亚株CNE2/DDP在含10%小牛血清和高糖的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃、5% CO_2 饱和度。湿度培养箱。在包含 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的完整消化物中进行消化和传代。流式细胞仪用于确定细胞周期和荧光药物罗丹明在细胞中的积累。绘制细胞生长曲线，计算倍增时间，光镜下观察细胞形态。四甲基唑蓝（MTT）法用于检测CNE2和CNE2。 DDP对顺铂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶和长春新碱四种常用抗肿瘤药物的中位抑制浓度（IC_(50))和耐药系数（.RI）。

2.96孔板接种对数生长期CNE2/DDP细胞，细胞密度1×10~5/ml，每孔100μl（10~4个细胞）。分为1个空白对照组和5个实验组，每组6个重复孔，实验组加入：贝伐单抗10μg/ml、顺铂0.1μg/ml、贝伐单抗10μg/ml+顺铂0.1μg/ml，顺铂0.2μg/ml，贝伐单抗10μg/ml+顺铂0.2μg/ml，培养72h，MTT法测定各组细胞存活率，然后计算药物杀灭率。以对照组6个孔的吸光度(OD)值为平均值，各实验组各孔吸光度值与平均值的比值为各孔的细胞存活率，1-存活率是每孔药物的杀灭率。用公式表示：杀灭率=（1-实验组各孔OD值/对照组平均OD值）×100%。采用.0软件中的One-Way方法分析各实验组药物杀灭率的差异。 3.CNE2/DDP细胞常规在50ml培养瓶中培养。显微镜下观察细胞贴壁生长，顺铂0.1μg/ml，顺铂0.1μg/ml+ 10μg/ml，CNE2/DDP 1瓶作为空白对照，细胞培养24小时后收集，用V和碘化丙啶（PI）双染，流式细胞仪（FCM）检测每瓶细胞的凋亡情况。实验重复3次，在软件.0中采用-H秩和检验分析不同处理间细胞凋亡的差异。

4.在CNE2/DDP细胞培养基中加入贝伐单抗，终浓度为10μg/ml，细胞每4天传代一次，连续传代4次，得到CNE2/DDP/Bev细胞采用半定量RT-PCR检测CNE2、CNE2/DDP和CNE2/DDP/Bev细胞中MDR1、Bcl-2、Bax等基因的表达情况。计算相对表达水平。 5.建立耐鼻咽癌CNE2/DDP裸鼠皮下肿瘤模型，25只携带CNE2/DDP异种移植物的裸鼠随机分为5组进行药物治疗（肿瘤直径至少5mm）： ①空白对照组（A组）：无菌生理盐水； ②单药贝伐单抗组（B组）：5 mg/kg； ③顺铂单药组（C组）：4 mg/kg； ④联合组1（D组）：贝伐单抗5mg/kg+顺铂4mg/kg； ⑤联合组2（E组）：贝伐单抗5mg/kg+顺铂2mg/kg，均为腹腔注射（0.5ml/只/次），2次/周，连续用药4周。其中，顺铂治疗组（C、D、E组）在给药前30分钟皮下注射（3mg/kg），以防止胃肠道反应。停药1周后，处死各组裸鼠称重。采集皮下移植肿瘤标本，测量肿瘤质量，计算抑瘤率。比较各组微血管密度的差异； RT-PCR进一步分析药物治疗后各组MDR1、Bcl-2、Bax等基因的表达情况。

各实验组数据采用.0软件单因素方差分析，两两比较采用LSD法(--)，P<0.05表示差异为具有统计学意义。研究结果：1.由生长曲线计算得到的CNE2和CNE2/DDP的倍增时间分别为17.13h和23.13h。 DDP对CNE2和CNE2/DDP的IC_(50)分别为0.03 μg/ml和0.45 μg/ml，RI为14.94，吉西他滨(, gem)、5-氟尿嘧啶 (5-,5-FU) 和长春新碱 (,VCR) 的 RI 为 17.62、6.60 和 14. , 分别为 17, 表明具有多药耐药和稳定耐药的特点。 CNE2/DDP低于CNE2（3.56vs.220.35)。光镜下CNE2/DDP形态变圆，大小不一，有2.细胞杀伤结果表明，单独使用10μg/ml贝伐单抗时，细胞杀伤率与空白对照组相似（5.2%±< @4.3%Vs.0.0%±<@ 4.1%,Hu=0.180). 10μg/ml贝伐单抗联合0.的杀伤作用@>1μg/ml 一个d 0.2μg/ml DDP, 分别高于单独使用 DDP (42.3%±6.5%vs.34.4%±< @5.4%,P=0.041;62.6%±5.5%vs.50.0%±5.9% ,P=0.009).

3.DDP联合贝伐单抗诱导CNE2/DDP细胞凋亡：与对照细胞相比，CNE2/DDP后用0.1μg/ml DDP或联合10μg/ml贝伐单抗处理24h细胞，存在明显的PS外化现象，即FITC高染区和PI低染区早期凋亡细胞增多（8.87%±1.06%Vs.3.25%±0.75%,38.20%±3.51%Vs.3.25%±0.75%),FITC在 PI 和 PI 的超染色区域，晚期细胞凋亡和继发性坏死细胞增加（41.71%±9.78%vs.5.70%±0.43 % ,48.96%±6.90%vs.5.70%±0.43%)，而 FITC 和PI下降。对照组与两个实验组的总凋亡率有显着差异（P=0.027),0.1μg/+10μg/ml贝伐单抗组）率（87.29%±3.38%）高于单独DDP组（50.58%±8.83%）。4.@ >半定量RT-PCR检测显示MDR1在CNE2、CNE2/DDP和CNE2/DDP/Bev中的相对表达量分别为0.623、1. 364 和 1.165，Bcl-2 是 0.613、0.952 和 0.135，Bax 是 0.665、@ > 0.387和1.751.5.治疗后顺铂常规剂量组（C组和D组）裸鼠体重较其他组有所下降（ P<0.001)，而其他各组体重无显着差异（P>0.05)。

与空白对照组相比，联合用药组（D组和E组）移植瘤的生长明显受到抑制，抑瘤率为59.37%±3.@ >29%，分别为 63.17%±3.05%，差异显着（P<0.001)，单药贝伐单抗和单药顺铂组的抑瘤率仅为6.03%±4.68%，5.71%±8.30%，两组间无显着差异对照组和对照组（P=0.067，P=0.081)，两个联合组的抑瘤率无差异（P=0.@ >235);贝伐单抗治疗组（B、D、E组）微血管密度表达下降（分别为13.60±1.11、1< @2.80±0.90、13.22±1.02)，P值都是<0.001 ; RT-PCR结果也显示，空白组与对照组相比，Bcl-2 mRNA表达on 下调（P<0.001)，Bax mRNA 表达上调（P<0.001)，但无差异）三组，各实验组MDR1 mRNA表达差异无统计学意义（P=0.918)。结论：1.贝伐单抗可显着提高人鼻咽癌顺铂敏感性- 对顺铂耐药的细胞系 CNE2/DDP。贝伐单抗联合顺铂的细胞杀伤活性最强，单独使用贝伐单抗的杀伤效果不明显，增加贝伐单抗联合使用的浓度并不能提高杀伤率。2.贝伐单抗可以促进耐顺铂的鼻咽癌细胞CNE2/DDP凋亡。

贝伐单抗联合顺铂的细胞凋亡率明显高于单用顺铂。 3.贝伐单抗对耐药相关基因影响不大，但能显着影响凋亡相关基因的表达，促进耐药细胞的凋亡。对于亲代CNE2细胞，顺铂诱导耐药后贝伐单抗处理后，MDR1的表达先显着上调，后略有下调； Bcl-2基因（凋亡抑制基因）的表达先上调后显着下调； Bax基因(促凋亡基因)的表达先下调后显着上调。 4.贝伐单抗对CNE2/DDP荷瘤裸鼠异种移植有显着抑制作用，同时增加CNE2/DDP耐药细胞对顺铂的敏感性。两者结合具有显着的协同效应。其机制可能与抑制微血管形成和诱导细胞凋亡有关。综上所述，VEGF单克隆抗体贝伐单抗可通过诱导耐药鼻咽癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。