肺癌的耐药与靶向耐药耐药的关系分析与投资策略

【摘要】 肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-cell lung）是肺癌的主要组织学类型，占肺癌的主要组织学类型。所有肺癌。 85%左右。大多数肺癌患者发现时已处于晚期，预后较差。近年来，以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（-，EGFR-TKI）吉非替尼（）为代表的分子靶向药物替代了传统的细胞毒药物，并在晚期EGFR敏感突变（主要包括外显子19缺失突变、外显子21点突变患者的治疗）。然而，经过一段时间的治疗（中位时间为8-12个月），大部分患者会对EGFR-TKI产生获得性耐药，限制了其临床应用和疗效，成为晚期靶向治疗亟待解决的关键问题。一。许多研究证实EGFR-TKI耐药与EGFR二次突变、旁路激活和表型转换有关。针对已发现的耐药机制，EGFR-TKI不断更新，各种联合化疗方案也在临床开发中，但效果仍不尽如人意。因此，探索新的耐药机制还有很长的路要走。

基因是本课题组在前期研究中首次发现、报道并证实的肺癌顺铂耐药相关新基因。可能通过PI3K/AKT通路参与顺铂耐药，耐药机制与抗凋亡顺铂耐药有关。与死亡有关。研究亚组分析发现，EGFR突变患者与非EGFR突变患者化疗的客观缓解率存在显着差异，提示化疗耐药与靶点耐药之间可能存在相关性。但迄今为止，基因在EGFR-TKI耐药中的作用及其分子机制尚未见报道。因此，我们推断促进顺铂耐药也可能在非小细胞肺癌细胞对EGFR-TKI靶向药物的耐药中发挥重要作用。本研究拟通过一系列体外和体内实验来证实这一假设，并初步探索其可能的分子机制。本研究的主要方法、结果和结论如下：1.通过间歇诱导方法促进细胞对EGFR-TKI的耐药（1)在EGFR-TKI获得的耐药细胞中高表达，我们诱导了两个EGFR-TKI获得性耐药菌株PC9/GR（吉非替尼耐药菌株）和/IR（埃克替尼耐药菌株），qRT-PCR和Blot检测显示，这两种EGFR-TKI耐药菌株的mRNA和蛋白表达水平分别为显着高于亲代细胞（p0.01)，表明它可能在细胞对EGFR-TKI的获得性抗性中起作用。

(2)沉默/过表达显着改变细胞对EGFR-TKI的敏感性为了探索EGFR-TKI获得性耐药的作用，我们构建了稳定沉默的PC9/GR和/IR和稳定过表达的PC9和结果表明，敲低表达后，耐药细胞PC9/GR和/IR对EGFR-TKI的敏感性显着增加（p0.01);相比之下，稳定过表达（over-）显着降低敏感细胞中PC9和EGFR-TKI的敏感性。这些结果表明它是促进细胞对EGFR-TKI获得性耐药的重要分子。2.敲低减弱异种移植物的生长来源于体内耐药细胞并增加异种移植物对TKI的敏感性为了进一步验证细胞EGFR-TKI获得性耐药的作用，我们在小鼠体内进行了实验，我们将稳定敲除吉非替尼耐药细胞系PC9/GR - 其对照细胞是给NOD/SCID小鼠皮下注射建立异种移植物模型，并用吉非替尼/安慰剂治疗，观察对异种移植物生长的影响。影响。

实验结果表明，敲除后，吉非替尼耐药细胞株形成的异种移植瘤在小鼠体内的生长受到显着抑制（p0.05)。结果还表明，吉非替尼治疗敲低组疗效更好，即敲低联合吉非替尼治疗组异种移植瘤的体积和重量明显小于对照组（p0.001). 3.减弱EGFR-TKI诱导的细胞凋亡的作用我们从细胞凋亡的角度研究了EGFR-TKI获得性耐药的影响。用V-APC/PI双染法检测敲除后的细胞凋亡率EGFR-TKI药物低表达或过表达后，实验结果表明，敲低可显着提高EGFR-TKI药物作用下耐药细胞的凋亡率(p0. 001);相反，敏感细胞中的过表达可以显着降低EGFR-TKI药物诱导的细胞凋亡率(p0.001).这些实验结果表明，可能通过影响细胞凋亡来影响细胞对EGFR-TKI的敏感性。4.可能是介导和促进EGFR-TKI耐药的关键分子，以探索促进EGFR-TKI的机制。抗性，我们进行了转录组测序（RNA-Seq），用于比较敲低PC9/GR细胞和对照细胞的基因表达谱。

结果表明，敲低后该分子显着下调，经qRT-PCR验证； qRT-PCR和Blot分析显示，它与该分子的表达呈正相关。有人认为它可能是促进EGFR-TKI耐药的关键分子。 5.可能通过调节Bcl-2/Bax的表达来抑制细胞凋亡 为了进一步探索促进细胞抗凋亡的分子机制，我们通过Blot筛选了关键的凋亡分子BCL-2家族相关分子，结果显示，在耐药细胞株中敲低后，表达下降，促凋亡蛋白BAX表达增加，抗凋亡蛋白BCL-2表达下降；相反，在敏感细胞系中，表达增加，促凋亡BAX的表达增加。减少，抗凋亡蛋白 BCL-2 的表达增加。这些结果表明，可能通过调节 Bcl-2/Bax 的表达以促进其对 EGFR-TKI 的抗性来促进细胞凋亡的抑制。结论：1.EGFR-TKI获得性耐药细胞高表达；2.通过抑制EGFR-TKI诱导的细胞凋亡促进细胞对EGFR-TKI的耐药。 3.可能通过调节Bcl-2/Bax的表达抑制EGFR-TKI诱导的细胞凋亡。