全球第六位致死性的肿瘤——食管腺癌的发生率类型

【摘要】食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，也是全球第六大致死性肿瘤。根据组织学类型，食管癌主要分为腺癌和鳞状细胞癌两种，两种类型预后均较差。尽管在过去的 30 年中，美国和欧洲的食管腺癌发病率显着增加，但食管鳞状细胞癌仍然是主要的组织学类型。食管癌的发病具有明显的地域差异，其高发地区主要分布在中国、中亚和南亚、东非和南非，尤其是中国河南省林州市和安阳市。目前食管鳞癌的5年生存率很低，约为5%-10%，超过50%的患者在确诊时发现有远处转移。因此，寻找新的分子靶点对食管鳞癌患者的诊断和改善预后具有重要意义。人宫颈癌基因-1 ( , HCCR-1） 是Ko等人发现的与多种人类肿瘤相关的基因。在细胞系中筛选出候选差异表达基因之一，并鉴定出几个新的癌基因，包括HCCR基因，该基因被证实在原发性宫颈癌和宫颈癌细胞系中过表达。HCCR根据其分子特征，主要分为两类：HCCR-1和HCCR-2两种蛋白剪接变异体。HCCR-1编码360个氨基酸，分子量约304个氨基酸，HCCR-2编码304个氨基酸，分子量约.

它们具有 2 个潜在的 N-肉豆蔻基化位点、2 个潜在的蛋白激酶 C 磷酸化位点、N-糖基化位点和 20 个氨基酸疏水跨膜结构域，这些复杂的结构表明功能的多样性。目前，越来越多的研究表明，HCCR-1作为一种癌基因，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，并且在多种不同肿瘤中过度表达，包括乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和肝癌，提示HCCR-1可能成为诊断和治疗这些肿瘤的分子靶点。最重要的是，HCCR-1可以通过多种不同的分子机制影响肿瘤的发生和发展。研究表明TCF/β-在HCCR-1原癌基因的表达中起重要作用，在PANC-1胰腺癌细胞中，表皮生长因子（EGF）可以通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导HCCR的表达途径。这些研究表明，HCCR-1的发生发展涉及的分子机制是多方面的，从而揭示了其在肿瘤发生发展中的重要作用。吉非替尼是一种口服活性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，对多种肿瘤具有抗肿瘤活性，包括头颈部肿瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、恶性间皮瘤和结肠癌。近期，食品药品监督管理局批准吉非替尼作为治疗晚期非小细胞肺癌的靶向药物，其他肿瘤的临床试验仍在研究中。

I期和II期临床研究表明，吉非替尼不仅具有很强的抗肿瘤活性，而且耐受性良好。此外，EGFR 的选择性抑制剂吉非替尼能够以浓度依赖性方式阻断外源性 EGF 诱导的头颈部肿瘤中 VEGF-C 和 VEGF-A 的表达。上述研究提示HCCR-1、吉非替尼与肿瘤细胞中EGF之间存在内在联系，因此在本研究中，我们通过三个部分阐明HCCR-1和吉非替尼在食管中的作用。鳞状细胞癌的可能作用及其在鳞状细胞癌发生发展中的分子调控机制[J].本研究旨在为食管鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供理论依据。第一部分是HCCR-1在食管鳞癌组织中的表达及其与食管鳞癌患者预后的关系。 HCCR-在158个正常食管黏膜组织中的表达。 (2）免疫组化检测HCCR-1蛋白在158例食管鳞状细胞癌组织、105例非典型增生组织和158例正常食管黏膜组织中的表达情况。(3）HCCR-在食管鳞癌组织中的表达水平)对随机选取的6例食管鳞状细胞癌组织和对应的6例正常食管黏膜组织进行实时定量PCR分析。正常食管黏膜6例。

(5）-生存曲线用于分析食管鳞癌患者HCCR-和蛋白表达与生存时间的关系。(6）统计处理：采用.0统计软件进行统计处理，统计数据用 x s 表示。原位杂交和免疫组化结果使用 X2、实时 PCR 和结果使用单向方差分析 (One-)、HCCR- 和食管鳞状细胞癌的蛋白质表达和预后进行评估细胞癌患者 食管鳞状细胞癌与食管鳞状细胞癌的关系采用生存曲线分析，P<0.05表示差异有统计学意义。阳性率（77.22% ）显着高于非典型增生组织（36.19%）和正常食管黏膜组织（3.16%），差异有统计学意义（P0.0< @5）. (2）HCCR-1 蛋白n主要定位于食管鳞状细胞癌，食管鳞状细胞癌组织HCCR-1蛋白表达阳性率（79.75%）明显高于异型增生组织（40.@ >95%)和正常食管黏膜(3.80%)，差异有统计学意义(P0.@ >05）. (3）HCCR-和蛋白表达与食管鳞状细胞癌患者的性别和年龄无关(P0.05），但与患者的组织分级、TNM有关)分期与淋巴结转移密切相关（P0.05）.

最值得注意的是，80例转移性食管鳞状细胞癌患者HCCR-和蛋白表达的阳性率为100%。 (4）相关分析结果显示，122个HCCR阳性组织中发现110例HCCR-1蛋白，而在36个HCCR阴性组织中发现20例HCCR-1蛋白。 HCCR-与蛋白表达呈显着相关(γ=0.447, P0.001）.(5）实时定量PCR及结果表明HCCR-随机抽取的6个食管鳞状细胞癌组织中的蛋白表达和蛋白表达均显着高于正常食管黏膜组织，差异有统计学意义（P0.05）.（0.0 5）.6）随访期间，104例HCCR阳性食管鳞癌患者中有72例死亡，病死率为69.23%，而HCCR阴性或弱者54例食管鳞癌阳性患者死亡17例，死亡率31.48%。对数秩检验（-Cox）发现HC患者的生存时间CR-低表达食管鳞状细胞癌明显长于HCCR-高表达食管鳞状细胞癌。癌患者，差异有统计学意义（P0.05）。（7）随访期间，113例HCCR-1蛋白阳性食管鳞癌患者中有77例）有死亡，死亡率为68.14%，45例HCCR-1蛋白阴性或弱阳性食管鳞癌患者中有15例死亡，死亡率为33.33% ，通过对数秩检验（-Cox）发现，HCCR-1蛋白低表达的食管鳞癌患者的生存时间明显长于HCCR-1蛋白高表达的食管鳞癌患者，且差异有统计学意义（P0. 05）.

(8）Cox比例风险模型结果显示临床分期和淋巴结转移是ESCC的独立预后因素。第二部分靶向抑制HCCR-1表达增加了吉非替尼对ESCC细胞的作用敏感方法采用(1）实时定量PCR及技术检测3株食管鳞状细胞癌细胞(、EC1和)和非癌性食管上皮细胞Het-1A中HCCR-和蛋白的表达。 (2）HCCR-转染食管鳞癌EC1细胞，实时荧光定量PCR及技术检测转染前后HCCR-及蛋白的表达。(3）24h后HCCR转染食管鳞癌EC1细胞48h、72h、96h，CCK-8试剂检测EC1细胞增殖能力，不同浓度处理食管鳞癌EC1细胞笔尖（0.1M、1M、10M、20M 和 40M）。 , CCK-8试剂用于检测处理后48小时细胞的增殖能力。 （4）流式细胞仪检测不同治疗组（未治疗组、对照组、HCCR组、吉非替尼组和HCCR组）-和吉非替尼联合组）细胞周期和细胞凋亡的变化。 (5）小室检测不同处理组细胞侵袭能力的变化。

(6）技术用于检测细胞周期相关蛋白(、cdk2和p21）、凋亡相关蛋白(bcl-2和bax)、细胞侵袭相关蛋白(MMP))不同处理组-2和MMP-9）以及Akt信号通路中关键蛋白（p-Akt和总Akt）的表达水平。（7）统计处理：.0软件用于统计处理，数据以x s表示，两组数据比较采用独立样本t检验，三组及以上数据进行单因素方差分析（One-） P0. 05表示差异显着。结果（1） HCCR-和蛋白在三种食管鳞状细胞癌细胞系（、EC1和）中的相对表达水平显着高于非癌性食管上皮细胞Het-1A。 , 而食管鳞状细胞癌 EC1 细胞中 HCCR- 和蛋白的相对表达水平显着升高。显着高于He细胞，差异有统计学意义（P0.05）. (2）与未处理组和对照组相比，HCCR-转染后24h、48h EC1细胞HCCR-和蛋白在72h和72h表达均显着下调，差异有统计学意义(P0.05）,其中HCCR-和蛋白的表达在HCCR-转染48h后最低。

(3）CCK-8细胞增殖实验表明，与未处理组和对照组相比，HCCR处理不同时间点食管鳞状细胞癌EC1细胞的增殖明显受到抑制，显着差异有统计学意义，但未治疗组与对照组食管鳞状细胞癌EC1细胞增殖差异无统计学意义（P0.05）。（4）吉非替尼抑制食管鳞癌EC1细胞增殖呈浓度依赖性，40M吉非替尼对食管鳞癌EC1细胞有较好的抑制作用，抑制率为92.14%，显着高于其他组，差异有统计学意义（P0.05）。1M和10M吉非替尼对食管鳞状细胞癌EC1细胞的抑制率分别为42.5%和5% 6.5%，与 w 相比其他各组，差异有统计学意义（P0.05）. (5）未处理组和对照组EC1细胞在G0/G1期的比例分别为45.390.64%和46.370. @>63%，两组之间无统计学差异（P0.05）。与未治疗组和对照组相比，HCCR组（58.@ >330.83%)、非替尼组(57.630.76%)和联合组(71.580. 87%) G0/G1期细胞数比显着增加。差异有统计学意义(F=600.333, P=0.000.9@>。最显着的是，G0在HCCR-与吉非替尼联合治疗组/G1期细胞比例最高。

另外，未处理组和对照组的S期EC1细胞比例分别为24.150.89%和22.021.45%，两组比较差异无统计学意义（P0.05）。HCCR-组和吉非替尼组S期发生率分别为29.301.@ >，分别为99%和29.430.79%，两者无统计学差异（P0.05），但明显高于未治疗组与对照组相比，组间差异有统计学意义（P0.05）。联合治疗组S期比例为13.050.@ >80%，上述各组均显着降低（P0.05）。（6）HCCR-组、吉非替尼组和联合组，食管鳞状细胞早期凋亡率癌 EC1 为 26） @6.731.73%、23.632.48% 和 31.792.04 %，显着高于未治疗组 (11.391.62%) 和 con对照组（11.691.30%），差异有统计学意义（F=71.196，P=0.000.9@>，而未治疗组与对照组食管鳞状细胞癌EC1早期凋亡率差异无统计学意义（P0.05），此外，与其他组比较，早期凋亡率与对照组比较）联合治疗组食管鳞癌EC1细胞明显增多，差异有统计学意义（P0.05）. (7）@ >HCCR组、吉非替尼组和联合组食管鳞状细胞癌EC1的跨膜细胞数为139.227.37、@​​>160. @> 626.75 和 48.822.77，显着低于未治疗组（269.426.70.9@> 和对照组（252.827.90.9@>，差异有统计学意义（F=58.244，P=0.000.9 @>,但未治疗组与对照组食管鳞状细胞癌EC1的穿透细胞数无差异(P0.05）,另外,联合治疗组食管鳞状细胞癌EC1细胞数较其他组显着降低，差异有统计学意义（P0.05）。

(8）细胞周期相关蛋白（D1、cdk2和p21），凋亡相关蛋白（bcl-2和bax），细胞侵袭相关蛋白（MMP- 2 和 MMP-9），以及 Akt 信号通路中的关键蛋白（p-Akt 和总 Akt）没有统计学差异（P0.05）；然而，D1、cdk2、bcl-2、@ HCCR-和吉非替尼组与未治疗组和对照组相比 >MMP-2、MMP-9 和 p-Akt 蛋白显着下调，而p21和bax蛋白显着上调，差异有统计学意义（P0.05）。最显着的是，当HCCR-和吉非替尼与食管鳞状细胞癌EC1细胞联合使用时，上述蛋白的表达水平变化最为显着，与其他组相比差异有统计学意义（P0.05）。第三部分是HCCR-联合吉非替尼对食管的影响。鳞状细胞癌异种移植物在裸鼠中（1）实验组：未处理组：不进行任何处理；对照组：将对照注射到肿瘤内，每3天一次； HCCR-组：肿瘤后注射HCCR-，每3天一次；吉非替尼组：口服吉非替尼（/kg）； HCCR-联合吉非替尼组：HCCR-肿瘤后注射，每3天一次，吉非替尼（/kg）口服。

(2）采集食管鳞状细胞癌EC1细胞，在裸鼠右背部皮下接种5×106个细胞。当肿瘤体积达到30左右时，开始治疗，肿瘤长度每3天用游标卡尺精确测量一次，直径a（mm）和短径b（mm）用公式V=1/2ab2（mm3）计算每个裸核的肿瘤体积）小鼠，绘制各组肿瘤的生长曲线，处理3w后处死小鼠，将小鼠从肿瘤中取出，称重肿瘤重量，计算抑瘤率。抑瘤率= [(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重]×100%。(3）采用免疫组化法检测各组Ki-67蛋白表达裸鼠食管鳞状细胞癌异种移植物的研究. (4）实时定量 P CR用于检测不同组食管鳞癌裸鼠移植瘤中HCCR-的表达。 (5）采用技术检测不同组食管鳞癌裸鼠移植物中HCCR-1、p-Akt和总Akt蛋白的表达情况。(6）统计处理：所有实验数据均采用0.0统计软件进行统计处理，统计数据以x±s表示，两样本均值比较采用t检验，均值比较采用单因素方差分析P0.@ >05 表示有统计学差异。结果（1）未处理组和移植的食管鳞状细胞癌EC1裸鼠的肿瘤体积大小无差异。对照组（P0.05）@ >，与未治疗组和对照组相比，HCCR组和吉非替尼组食管鳞癌EC1裸鼠体积明显变小，差异有统计学意义（P0. 05）.

最显着的是，HCCR-与吉非替尼联合治疗时，裸鼠食管鳞癌EC1异种移植瘤体积明显低于其他组，差异有统计学意义（P0.0 5）.(2）未治疗组与对照组移植食管鳞癌EC1裸鼠体重差异无统计学意义(P0.05）@ >，与未治疗组和对照组相比，HCCR组和吉非替尼组对裸鼠食管鳞状细胞癌异种移植物的抑瘤率分别为38.83%和43. 92%，移植瘤重量明显减轻，差异有统计学意义（P0.05）。另外，HCCR联合吉非替尼组的肿瘤抑制率为7< @7.25%，差异有统计学意义（P0.05）.（3）HCCR- Th食管鳞状细胞癌及蛋白表达无差异（P0.05），而与未治疗组和对照组相比，HCCR-食管鳞状细胞癌EC1缺失）组、吉非替尼组和联合治疗组小鼠异种移植瘤中HCCR-和蛋白表达明显下调，联合组HCCR-和蛋白表达水平最低。 (4）未治疗组和对照组Ki-67肿瘤细胞增殖指数分别为8，分别为5.77±2.40%和84.87± 2.42%，两者无统计学差异（P0.05），此外HCCR组、吉非替尼组及联合治疗组Ki-67增殖指数组分别为：47.85±3.23%、56.52±3.73%和31.26±2.69% ,差异有统计学意义(P0.05）,联合治疗组肿瘤细胞Ki-67增殖指数最低。

(5）未治疗组和对照组食管鳞状细胞癌异种移植物中p-Akt和总Akt蛋白表达差异无统计学意义(P0.05） @>，而与未治疗组和对照组相比，HCCR组、吉非替尼组和联合治疗组食管鳞癌EC1裸鼠移植瘤中p-Akt蛋白的表达明显下调。蛋白水平最低，差异有统计学意义（P0.05）。结论（1）HCCR-和蛋白的高表达可能与发生、发展密切相关） (2）HCCR-和蛋白水平可能成为食管鳞状细胞癌转移和预后的分子标志物。(3）HCCR-和吉非替尼联合显着抑制食管鳞状细胞癌的增殖)细胞和累积 G0/ 数量r, G1 期细胞凋亡的诱导和细胞侵袭能力的降低可能与细胞周期相关蛋白 (D1、cdk2 和 p21）, 凋亡相关蛋白 (bcl- 2和bax），细胞侵袭相关蛋白（MMP-2和MMP-9）的表达变化，与Akt信号通路的激活状态密切相关。 (4）HCCR-和吉非替尼联合显着抑制食管鳞状细胞癌)裸鼠肿瘤异种移植物的生长可能与Ki-67增殖指数降低和Akt信号通路失活密切相关。 (5）HCCR-和吉非替尼在体外和体内抗食管鳞状细胞癌中具有协同增殖作用。