：肝癌细胞中差异性表达的原因及解决办法！

【摘要】目的：通过芯片和qRT-PCR筛选和确认索拉非尼治疗前后肝癌细胞的差异表达。初步探讨上述差异表达对肝细胞癌血管生成的调控作用及潜在分子机制。方法：第1部分，索拉非尼诱导肝癌细胞miR-375表达上调1.加入不同浓度的索拉非尼和Hep G2，48h，测定索拉非尼对Hep G2的IC50；2.提取索拉非尼治疗前后肝癌细胞的RNA进行微阵列检测分析，筛选差异表达；3.基于miR-375等的差异表达，在微阵列上进行筛选，qRT-采用PCR方法检测不同浓度索拉非尼治疗前后肝细胞癌细胞中miR-375表达的变化；第二部分，miR-375抑制肝细胞癌组织中血管生成的作用及机制； miR-375在肝癌细胞系、Hep G2、Huh1、Huh7和正常肝细胞系LO2中的表达差异；2.慢病毒感染过表达miR-375的肝癌细胞，以及qRT-PCR用于确认miR-375在肝癌细胞中的过表达效率；CCK-8增殖试验、克隆形成试验、实验、划痕试验和凋亡试验用于检测miR-375的表达。 375 肝癌细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移和凋亡的影响；4.分别使用体外和体内血管腔形成试验、大鼠主动脉环出芽试验和鸡胚绒毛膜尿素膜血管生成试验检测miR-375对肝癌血管生成的影响；5.基于生物信息学软件对miR-375潜在下游靶基因的预测，采用qRT-PCR、IHC检测临床肝癌组织及邻近组织6.使用qRT-PCR检测表达肝癌细胞系Hep G2、Huh1、Huh7与正常肝细胞系LO2的差异；使用慢病毒载体和miR-375抑制剂分别在肝癌细胞中过表达和下调miR-375，并通过qRT-PCR和检测的表达变化来阐明miR-375的调控功能； 7.使用双荧光素酶实验阐明了miR-375调控的分子机制；8.肝癌细胞在外源补充人重组蛋白的同时通过RNAi实验敲除miR-375，利用血管腔形成，大鼠主动脉“拯救实验”如环出芽和鸡胚绒毛膜尿素膜血管生成，确定 miR-375 是否通过直接调控表达抑制肝细胞癌的血管生成； 9.利用裸鼠成瘤实验在全动物水平检测miR-375-375对裸鼠肿瘤生长、血管生成和存活时间的影响； 10.索拉非尼治疗肝癌细胞的同时，使用miR-375的抑制剂下调miR-375的表达，使用qRT-PCR下调miR-375的表达miR-375。和检测表达变化；明确索拉非尼是否通过诱导miR-375的表达上调被抑制的表达；第三部分，通过检测miR-375过表达和下调后AKT和ERK1/2的磷酸化水平，初步研究miR-375在肝癌细胞下游信号通路中的调控作用；结果：第1部分，索拉非尼诱导肝癌细胞miR-375表达上调1.索拉非尼和Hep G2的IC50分别为2.77u M，3.28u M； 2.微阵列结果显示，索拉非尼可诱导miR-375表达上调； 3.qRT-PCR结果显示索拉非尼诱导肝癌细胞miR-375表达呈浓度依赖性上调；第二部分，miR-375抑制肝癌血管生成的作用及机制研究< @1.qRT-PCR结果显示，临床肝癌组织中miR-375的表达明显低于癌旁组织，临床肝癌组织中miR-375的表达明显升高。肝癌细胞株Hep G2、Huh1、Huh7的表达明显低于正常肝细胞株LO2； 2.慢病毒感染后出现大量绿色荧光蛋白表达，qRT-PCR结果miR-375成功过表达； 3.CCK-8增殖试验和克隆形成试验表明：miR-375显着抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成能力；侵袭试验结果显示，miR-375显着抑制肝癌细胞的侵袭能力；迁移和划痕实验表明：miR-375显着抑制肝癌细胞的迁移能力；凋亡实验表明：miR-375显着促进肝癌细胞凋亡； 4.血管管腔形成实验结果表明：miR-375显着抑制血管管腔的形成；大鼠主动脉环发芽实验结果表明：miR-375显着抑制大鼠主动脉环的发芽和生长；鸡胚绒毛膜尿素膜血管生成实验结果表明：miR-375显着抑制鸡胚绒毛膜尿素膜的血管生成； 5.生物信息学软件7.1预测它可能是miR-375的下游靶基因； qRT-PCR、IHC结果显示：临床肝癌组织中表达明显高于癌旁组织； 6.qRT-PCR，结果显示肝癌细胞株Hep G2、Huh1、Huh7的表达明显高于正常肝细胞株LO2； qRT-PCR, 和结果显示，过表达miR-375后miR-375表达降低，抑制miR-375表达后表达上调； 375直接作用于-3,UTR；8.血管腔形成、大鼠主动脉环出芽、鸡胚绒毛膜尿膜血管生成等“抢救实验”和RNAi实验表明miR-375直接调控表达抑制9.@ >裸鼠致瘤实验结果表明，miR-375通过调控其表达直接抑制肿瘤生长，减少肿瘤血管生成，显着延长裸鼠存活时间；10.qRT-PCR和qRT-PCR表明索拉非尼通过诱导miR-375表达上调来抑制miR-375的表达；第三部分，miR-375调控肝癌细胞下游信号通路的初步研究结果提示miR-375过表达显着抑制AKT和ERK1/2磷酸化； miR-375的下调显着促进AKT和ERK1/2的磷酸化；结论：1.索拉非尼以浓度依赖性方式诱导肝癌细胞中miR-375的上调。 2.miR-375 通过抑制表达来抑制肝癌的血管生成。 3.索拉非尼通过诱导miR-375表达上调来抑制表达。 4.miR-375 抑制下游信号通路 Akt 和 ERK1/2 的磷酸化和活化。