表皮生长因子受体(,EGFR)酪氨酸激酶耐药的关系研究

【摘要】：表皮生长因子受体( , EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂( , TKI) 吉非替尼( ) 是肿瘤靶向药物的突出代表。国外研究表明，吉非替尼可减少EGFR突变阳性非小细胞肺癌（Non-cell lung）患者的肿瘤病灶。 2011年《非小细胞肺癌临床实践指南（中国版）》将吉非替尼列为EGFR突变阳性患者的一线治疗。但临床经验和机制研究数据表明，持续应用后不可避免的耐药性是制约吉非替尼进一步应用的瓶颈。本研究的主要目的是建立吉非替尼耐药PC9细胞系，观察耐药前后EGFR信号通路信号分子磷酸化水平的变化，观察耐药细胞中PI3K下游转录因子的表达情况。系，并观察磷酸化化学水平的变化，探讨其与吉非替尼耐药的关系。目的体外培养人肺腺癌细胞株PC9，构建吉非替尼耐药细胞株PC9/GR，观察耐药前后EGFR信号通路信号分子磷酸化水平的变化，观察其表达情况。 PI3K 下游转录因子。在耐药细胞株中的表达，观察磷酸化水平的变化，探讨EGFR通路信号分子与吉非替尼耐药的关系。

方法1.细胞培养实验中使用的PC9细胞和PC9/GR细胞均在37℃±0.3℃、相对湿度≥95%、CO2的环境条件下使用。浓度为 5%±0.1% 的细胞培养箱并在含有 10% 胎牛血清的 DMEM 高葡萄糖培养基中进行继代培养。 2.吉非替尼耐药PC9细胞株的建立 传代培养DMEM高糖培养基，筛选出在0.5 μmol/L吉非替尼下能稳定生长的贴壁细胞。 3.吉非替尼对不同耐药程度PC9/GR细胞株的影响0.5,1,5,10,50,100,500,1000,5000,/L，处理时间72h。 4.吉非替尼对敏感细胞系PC9中EGFR通路信号分子磷酸化水平的影响。不同浓度的吉非替尼(0,0.5,1,2,4μmol/L)对处理敏感 细胞系PC 91 h后，提取细胞蛋白，Akt和Erk1/2磷酸化变化Blot 检测 EGFR 信号转导通路中的水平。敏感细胞系PC9用吉非替尼1 μmol/L处理不同时间（0,1.5,3,6,12h），提取细胞蛋白，EGFR信号中的Akt和Erk1/2磷酸化通过化学水平的Blot变化检测转导通路。

5.吉非替尼对不同耐药程度PC9/GR细胞株/GR细胞株EGFR通路信号分子磷酸化水平的影响1h，提取细胞蛋白，用Blot检测变化EGFR、Akt、Erk1/2 磷酸化水平。结果1.吉非替尼对PC9细胞株形态的影响 倒置相差显微镜观察PC9和PC9/GR细胞的形态变化。 PC9细胞呈椭圆形，PC9/GR细胞呈长梭形，形态学改变明显。 2.吉非替尼对PC9增殖特性的影响及PC9/GR MTT结果显示敏感PC9细胞的IC50为0.05±0.011μmol/L。不同耐药程度PC9/GR的IC50分别为：PC9/GR1的IC50为0.11±0.015μmol/L，PC9/GR2的ICso为0.23±< @0.061μmol/L，PC9/GR3的IC50为0.45±0.047μmol/L，PC9/GR4的IC50为0.83±0.103μmol/ L，PC9/GR5的IC50为1.7±0.153μmol/L。比较敏感菌株PC9和PC9/GR5的IC50，耐药指数为17倍，表明成功建立耐药菌株。吉非替尼对 PC9 细胞的增殖具有浓度依赖性作用。随着耐药性的增加，吉非替尼对PC9/GR的作用明显减弱。

3.吉非替尼对敏感细胞系PC9中EGFR通路信号分子磷酸化水平的影响 Blot结果显示，不同浓度的吉非替尼（0,0.5,1,2,4μmol/ L)处理敏感细胞系PC91 1小时后，PC9细胞中p-Akt和p-Erkl/2的表达随着浓度的增加呈浓度依赖性逐渐​​下降。吉非替尼1 μmol/L处理敏感细胞系PC9不同时间(0,1.5,3,6,12h)后，PC9细胞中p-Akt和p-Erk1/2的表达随时间变化。增加以时间依赖的方式逐渐减少。 4.吉非替尼对不同耐药程度PC9/GR细胞株EGFR通路信号分子磷酸化水平的影响/GR细胞株1h后，p-EGFR、p-Akt、p- Erk1/2和p-在细胞中存在显着差异。 p-Akt、p-Erk1/2和p-的表达水平随抗性程度的增加而变化。结论1.吉非替尼耐药PC9细胞系成功建立并命名为PC9/GR。 2.吉非替尼可显着抑制PC9细胞中p-Akt、p-Erk1/2的表达。 3.吉非替尼对EGFR信号转导通路p-EGFR、p-Akt、p-、p-Erk1/2的抑制作用随着耐药指数的升高而减弱。吉非替尼耐药与磷酸化密切相关。