鼻咽癌的整体治疗效果仍然不尽人意，抗血管生成成为肿瘤治疗新思路

【摘要】：研究背景与目的：鼻咽癌是我国南方及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一。大多数患者被发现时已处于晚期。据资料显示，III-IV期患者约占总数的85%。近年来大量临床研究表明，放疗联合化疗可以达到较高的治愈率，而单纯化疗在晚期鼻咽癌的治疗中取得了显着的效果，尤其是第三代替代化疗药物的出现，大大提高了鼻咽癌的治愈率。提高了鼻咽癌的治疗效果。吉西他滨 (2', 2-) 是阿糖胞苷的新一代类似物，是一种抗代谢抗癌药，是脱氧胞苷的衍生物。二氧胞苷二磷酸和二氧胞苷三磷酸，后者抑制DNA聚合酶，阻碍DNA合成，从而抑制肿瘤细胞生长。1996年被美国FDA批准为治疗胰腺癌的唯一药物。进一步研究发现，吉西他滨对头颈部肿瘤也有很好的疗效，尤其是对氟尿嘧啶耐药的复发转移晚期患者。吉西他滨的应用取得了显著成效。然而，鼻咽癌的整体治疗效果仍不能令人满意，大部分晚期患者仍因化疗失败而死亡，这在很大程度上归因于癌细胞的多药耐药性（MDR）。肿瘤多药耐药是指药物作用于肿瘤使其产生耐药后，

多药耐药细胞系的建立是体外多药耐药研究的基础。长期以来，肿瘤学家一直致力于寻找逆转肿瘤细胞耐药性的方法，但效果并不理想。目前认为，肿瘤的发生、发展和转移都离不开肿瘤血管生成，抗血管生成已成为肿瘤治疗的新思路。血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤血管生成中起核心作用，是迄今为止已知的最活跃和特异性最强的血管生成因子。贝伐单抗是一种针对VEGF的人源化单克隆抗体，于2004年被美国FDA批准用于晚期结直肠癌的一线治疗。VEGF及其受体在多种肿瘤中广泛表达，有报道鼻咽癌细胞阳性率为60%～90%，VEGF的表达与鼻咽癌的临床特征和预后不良有关。使用贝伐单抗治疗各种实体瘤和血液肿瘤的临床试验已达30余项，包括鼻咽癌在内的各种肿瘤的II期和III期临床试验结果均显示出良好的效果。临床观察发现，VEGF单克隆抗体与化疗药物联合建立的生化治疗模型不仅远优于单独化疗或VEGF单克隆抗体，而且超过了两者的代数和，特别是对于一些复发/转移患者。患者，

除了抑制肿瘤血管生成外，明显的抗肿瘤作用包括增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，很可能是通过逆转肿瘤细胞的耐药性。本实验的目的是： 1.诱导耐药人鼻咽癌细胞株的建立并研究其生物学特性。2、体外研究对耐药肿瘤细胞的作用，探讨其能否逆转肿瘤细胞的耐药性。研究方法： 1、根据文献报道，RT-PCR筛选5-8F、C666-1、CNE2等鼻咽癌细胞株VEGF和-2阳性表达，VEGF和-最终在 CNE2 细胞系中检测到 2。人鼻咽癌低分化细胞株CNE2在含10%小牛血清和高糖的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃、5% CO2饱和湿度培养箱。在包含 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的完整消化物中进行消化和传代。采用高剂量脉冲法和浓度梯度法建立人鼻咽癌多药耐药细胞株CNE2/Gem。流式细胞仪测定铂类、5-氟尿嘧啶、长春新碱等四种常用抗肿瘤药物的中位抑制浓度（IC_(50))和耐药系数（ , RI））的细胞周期和细胞内荧光药物罗丹明的积累，绘制细胞生长曲线，

2、对数生长期CNE2细胞接种于96孔板，细胞密度1×10~5/ml，每孔10~4个细胞。分为1个空白对照组和7个实验组，每组设6个重复孔，分别加入一定浓度的sum，培养72 h，按上述MTT法测定各组细胞存活率，然后计算药物杀灭率。以对照组6个孔的吸光度(OD)值为平均值，各实验组各孔吸光度值与平均值的比值为各孔的细胞存活率，1-存活率是每孔药物的杀灭率。它由以下公式表示：杀灭率=(1-实验组每孔OD值/对照组平均OD值)×100%。采用.0软件中的One-Way方法分析各实验组药物杀灭率的差异。3. CNE2和CNE2/Gem细胞常规在50ml培养瓶中培养。显微镜下观察细胞贴壁生长后，分别加入一定浓度的sum。具体为：加入1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem，浓度为20ug/ml；加入1瓶CNE2/Gem，浓度分别为20ug/ml和10ug/ml，另外1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem作为对照，置于37℃5% CO_2饱和湿度培养箱 24 小时。0软件分析各实验组药物杀灭率的差异。3. CNE2和CNE2/Gem细胞常规在50ml培养瓶中培养。显微镜下观察细胞贴壁生长后，分别加入一定浓度的sum。具体为：加入1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem，浓度为20ug/ml；加入1瓶CNE2/Gem，浓度分别为20ug/ml和10ug/ml，另外1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem作为对照，置于37℃5% CO_2饱和湿度培养箱 24 小时。0软件分析各实验组药物杀灭率的差异。3. CNE2和CNE2/Gem细胞常规在50ml培养瓶中培养。显微镜下观察细胞贴壁生长后，分别加入一定浓度的sum。具体为：加入1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem，浓度为20ug/ml；加入1瓶CNE2/Gem，浓度分别为20ug/ml和10ug/ml，另外1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem作为对照，置于37℃5% CO_2饱和湿度培养箱 24 小时。具体为：加入1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem，浓度为20ug/ml；加入1瓶CNE2/Gem，浓度分别为20ug/ml和10ug/ml，另外1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem作为对照，置于37℃5% CO_2饱和湿度培养箱 24 小时。具体为：加入1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem，浓度为20ug/ml；加入1瓶CNE2/Gem，浓度分别为20ug/ml和10ug/ml，另外1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem作为对照，置于37℃5% CO_2饱和湿度培养箱 24 小时。

收集细胞，用V和碘化丙啶(PI)双染，流式细胞仪(FCM)检测各培养瓶中细胞的凋亡情况。实验重复3次，采用.0软件中的One-Way方法分析不同处理方法间细胞凋亡的差异。4、加入CNE2/Gem细胞培养基中，终浓度为10ug/ml，每4天传代一次，连续传代4次，得到CNE2/Gem/Bev细胞。半定量RT-PCR检测CNE2、CNE2/Gem、CNE2/Gem/Bev细胞中MDR1、VEGF、Bcl-2、Bax等基因的表达，相对表达量为计算量。研究结果： 1、根据生长曲线计算CNE2和CNE2/Gem的倍增时间分别为17.13h和23. 13小时，分别。吉西他滨对CNE2和CNE2/Gem的IC_(50)分别为2.12ug/ml和37.04ug/ml，RI为17.62，和顺铂的 RI 为 17.62 (, DDP)、5-氟尿嘧啶 (5-, 5-FU) 和长春新碱 (, VCR) 的 RI 为 14.94、 6.60和1<@，分别为4.17，说明具有多药耐药特征。 @>56 与 220.35)。5-FU)和长春新碱(,VCR)分别为14.94、6.60和1<@，4.17，表明其具有多药耐药的特点。流式细胞仪显示，罗丹明在 CNE2/Gem 中的积累明显低于 CNE2（3.56 vs. 220.35)。5-FU)和长春新碱(,VCR)分别为14.94、6.60和1<@，4.17，表明其具有多药耐药的特点。流式细胞仪显示，罗丹明在 CNE2/Gem 中的积累明显低于 CNE2（3.56 vs. 220.35)。

光镜下CNE2/Gem形态呈圆形，大小不一，胞浆内颗粒较多。CNE2/Gem细胞可稳定传代，耐药性稳定。2、细胞杀伤结果显示：单独使用10ug/ml时，杀伤率与对照组相近，两者差异无统计学意义（P=0.140)，浓度加倍但杀灭率不显着）。高、低浓度组无显着差异（P=0.531)。无论是20ug/ml还是40ug/ml，10ug/ml的联合杀灭率均显着高于与单一处理相比差异有统计学意义（P=0.026，P=0.001).

751. 初步结论： 1. 在人鼻咽癌中成功建立了稳定的吉西他滨耐药细胞株CNE2/Gem，具有显着的多药耐药性。2.可显着提高人鼻咽癌吉西他滨耐药细胞株CNE2/Gem的敏感性。

单用杀灭效果不明显，合用可显着提高细胞杀灭活性。但增加浓度并没有提高杀灭率。3.人鼻咽癌吉西他滨耐药细胞株CNE2/Gem作用下，早期凋亡细胞较亲本细胞明显减少，联合应用后早期凋亡细胞明显增多。表明它能促进耐药细胞的早期凋亡。4、对耐药相关基因影响不大，但能显着影响凋亡相关基因的表达，促进耐药细胞的凋亡。对于亲本 CNE2 细胞，当 CNE 诱导耐药细胞，然后用 CNE2 处理耐药细胞时，MDR1的表达先显着上调，然后略有下调；VEGF基因表达先显着上调，后基本保持不变；Bcl-2基因（凋亡抑制基因的表达）先上调后显着下调；Bax基因(促凋亡基因)的表达先下调后显着上调。总而言之，VEGF单克隆抗体（ ）可以通过逆转肿瘤细胞的耐药性，或提高耐药肿瘤细胞的药物敏感性来发挥抗肿瘤作用。Bcl-2基因（凋亡抑制基因的表达）先上调后显着下调；Bax基因(促凋亡基因)的表达先下调后显着上调。总而言之，VEGF单克隆抗体（ ）可以通过逆转肿瘤细胞的耐药性，或提高耐药肿瘤细胞的药物敏感性来发挥抗肿瘤作用。Bcl-2基因（凋亡抑制基因的表达）先上调后显着下调；Bax基因(促凋亡基因)的表达先下调后显着上调。总而言之，VEGF单克隆抗体（ ）可以通过逆转肿瘤细胞的耐药性，或提高耐药肿瘤细胞的药物敏感性来发挥抗肿瘤作用。