EGFR-TKI肺癌的发病率和顺铂化疗的协同作用

[摘要]：研究背景 在全球范围内，肺癌的发病率和死亡率仍居所有癌症之首。近年来，我国肺癌发病率呈上升趋势，非小细胞肺癌（）约占肺癌总数的80%。. 过去，晚期治疗主要以含铂化疗为主。然而，随着EGFR-TKI药物的出现，EGFR敏感突变患者的生存率得到了极大的提高，但继发耐药是EGFR-TKI治疗后的最大问题。. 对于哪些EGFR-TKI耐药患者可以从EGFR-TKI联合含铂化疗中获益以提高治疗敏感性和延长生存期，目前尚无明确的分子分类，和临床研究有不同的结论，比如大规模的临床试验。研究表明EGFR-TKI联合含铂化疗之间没有协同作用，但也有很多临床报道表明一些耐药患者可以从EGFR-TKI联合含铂化疗中获益，说明EGFR-TKI的协同作用- TKI联合含铂化疗具有选择性 存在一些敏感人群，但目前单一的EGFR基因分型无法准确预测和筛选出有效人群。这是由于我们对EGFR-TKI联合含铂化疗的协同作用机制，特别是含铂化疗的核心药物顺铂之间的相互作用机制了解甚少，EGFR-TKI 尚不清楚。因此，本研究将研究吉非替尼与顺铂的联合作用，探讨其在EGFR-TKI耐药中的协同作用机制。

实验方法与结果 我们选取了三个EGFR-TKI耐药细胞系（A549、A549）作为研究模型，首先通过PCR扩增测序获得EGFR外显子18-21和K-ras外显子2-3。质子基因序列，验证细胞的EGFR和K-ras基因均为野生型，A549细胞为EGFR野生型，K-ras exon-2-G12S突变型，细胞为EGFR exon-21-, exon-20 -突变体，K-ras 野生型。MTT法和AV/PI流式细胞术检测，三种细胞系均对吉非替尼耐药，对顺铂的敏感性较低。我们进一步将吉非替尼和顺铂同时应用于三个细胞系，并通过MTT法和周中值药效学方法计算了每个细胞系的组合指数，发现吉非替尼和顺铂的组合具有协同作用在细胞上。, 对A549细胞有混合作用（即低浓度有拮抗作用，高浓度有协同作用），对细胞有拮抗作用。通过MTT法、细胞3D培养和AV/PI细胞流式细胞术发现，吉非替尼预处理只能增强顺铂对细胞和A549细胞的抗肿瘤和诱导凋亡能力，对细胞没有影响。动物模型实验也验证了顺铂联合吉非替尼对A549细胞肿瘤有协同抗肿瘤作用，但对细胞无协同作用。细胞3D培养和AV/PI细胞流式细胞术，发现吉非替尼预处理只能增强顺铂对细胞和A549细胞的抗肿瘤和诱导凋亡能力，对细胞没有影响。动物模型实验也验证了顺铂联合吉非替尼对A549细胞肿瘤有协同抗肿瘤作用，但对细胞无协同作用。细胞3D培养和AV/PI细胞流式细胞术，发现吉非替尼预处理只能增强顺铂对细胞和A549细胞的抗肿瘤和诱导凋亡能力，对细胞没有影响。动物模型实验也验证了顺铂联合吉非替尼对A549细胞肿瘤有协同抗肿瘤作用，但对细胞无协同作用。

印迹实验也证实，吉非替尼预处理后顺铂可更显着诱导细胞和A549细胞中-3和-3的表达，但对细胞无此作用。提示吉非替尼联合顺铂的协同作用可能取决于吉非替尼对顺铂的致敏作用，具有选择性。然后，我们研究了吉非替尼增强顺铂敏感性的机制。通过PCR扩增和测序对移植肿瘤组织的EGFR和K-ras基因进行重测序发现顺铂对组织的EGFR和K-ras基因状态没有影响。印迹试验发现顺铂联合吉非替尼对A549和细胞的EGFR/Akt/Erk/PTEN//的表达或激活没有差异，但吉非替尼可选择性抑制 A549 细胞的 DNA-PK。磷酸化的表达不会抑制细胞。采用MTT法检测细胞活力，发现细胞经DNA-PK抑制剂刺激后，吉非替尼对A549细胞顺铂致敏的作用消失，对细胞无影响。免疫共沉淀检测发现EGFR与DNA-PK在非小细胞肺癌中具有相互结合作用，EGFR与DNA-PK在A549细胞中的结合作用可被吉非替尼抑制，而细胞则不能。它对细胞没有影响。免疫共沉淀检测发现EGFR与DNA-PK在非小细胞肺癌中具有相互结合作用，EGFR与DNA-PK在A549细胞中的结合作用可被吉非替尼抑制，而细胞则不能。它对细胞没有影响。免疫共沉淀检测发现EGFR与DNA-PK在非小细胞肺癌中具有相互结合作用，EGFR与DNA-PK在A549细胞中的结合作用可被吉非替尼抑制，而细胞则不能。

免疫荧光标记法显示，吉非替尼可阻止A549细胞的EGFR进入细胞核与DNA-PK结合，但对细胞无此作用。印迹检测发现吉非替尼可以降低A549细胞核EGFR的表达，但对细胞没有影响。结论 吉非替尼联合顺铂对部分EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌具有协同抗肿瘤作用。吉非替尼联合顺铂的协同作用可能取决于吉非替尼对顺铂选择性致敏的作用。吉非替尼能否阻止EGFR进入细胞核并抑制DNA-PK激活，决定了吉非替尼与顺铂联合用药是否具有协同作用，单一的EGFR或K-ras基因状态不足以筛选这部分有效人群。只有充分了解吉非替尼抑制EGFR进入细胞核的选择机制，才有可能找到能够预测联合治疗效果的筛选指标。本研究为探索含铂化疗联合EGFR-TKI筛查指标的有效性提供了新思路。