RNAm6Ain--m6A耐药的机制与肝癌索拉非尼耐药

m6A 是 mRNA 中丰富的核苷酸修饰物。它可以调节mRNA的稳定性、剪接和翻译，但在肿瘤微环境和肿瘤耐药中是否具有生理作用尚不清楚。因此，小编为大家带来了发表在《The EMBO》上的文章《RNA m6A in -》，让大家了解m6A甲基化调控肝癌索拉非尼耐药的机制。

结果：

1. 在索拉非尼耐药肝细胞癌中下调

为了探究索拉非尼在肝癌中耐药的分子机制，我们从长期接受索拉非尼治疗的患者中获取了索拉非尼耐药的肝脏肿瘤，并进行了转录组测序。我们发现在索拉非尼耐药的肝脏肿瘤中，819 个基因显着上调，775 个基因显着下调。通过基因富集分析，我们发现了与耐药相关的几种信号通路的紊乱，包括细胞对化学刺激的反应、对有机物的反应和对氮化合物的反应（图1A）。这四个信号通路中有 13 个基因重叠（图 1B）。我们发现它在索拉非尼耐药的肝癌中显着下调（图 1C）。RT-PCR 进一步证实了对索拉非尼耐药肝肿瘤的下调作用（图 1D）。通过分析TCGA数据库中肝癌的病理分期图，我们发现肝癌晚期表达水平显着下调（图1E）。这些结果表明下调可能与 HCC 中的索拉非尼耐药有关。

为了证实索拉非尼耐药的作用，我们系统分析了数据库中HepG-2细胞和索拉非尼耐药HepG-2细胞的表达变化。我们发现它在索拉非尼耐药的肝癌细胞中显着下调（图 1F）。通过与原始 HepG-2 细胞进行比较，我们证实了这些细胞对索拉非尼的获得性耐药（图 1G）。此外，我们发现它在对索拉非尼耐药的HepG-2细胞中显着降低，总RNA m6A水平持续降低（图1H和I），表明它介导了抗索拉非尼对肝癌细胞的潜在作用.

2.基因敲除增强肝癌对索拉非尼的耐药性

为了评估整体 m6A 水平是否与肝癌的发生有关，我们在正常肝细胞系中生成了一系列不同的表达水平。正常肝细胞在沉默后形成扩大的集落，但过表达后没有显着变化（图 2A 和 B）。敲除后 SMMC-7721、Bel-7402 和 HepG-2 细胞对索拉非尼治疗的敏感性增加（图 2C 和 D）。此外，为了确定 m6A 在肝癌索拉非尼耐药中的作用，我们进行了救援实验（图 2E 和 F）。我们的结果表明，拯救对索拉非尼耐药的野生型肝癌细胞和 HepG-2 细胞将对索拉非尼治疗敏感（图 2G-J），

为了进一步确定如何控制索拉非尼在肝癌中的耐药性，我们测量了对人脐静脉内皮细胞成管能力的影响。结果表明，与对照组相比，基因敲除组肝癌细胞产生的肿瘤条件培养基显示出更强的成管能力（图2K和K-1)。此外，基因敲除组可以上调缺氧条件下肝癌细胞中FGF、PDGF-B和VEGF-A等血管生成标志物的RNA表达（图2L和M）。该印迹进一步证实了VEGF-A和PDGF-B的诱导蛋白水平（图 2N）和 O）。总之，我们的结果表明缺失增强了肝癌中的索拉非尼耐药性。

3.肝癌中依赖索拉非尼的耐药性是通过促进肝癌自噬介导的

先前的报告表明，自噬与人类癌症的化疗耐药有关。为研究m6A调控是否参与肝癌细胞自噬介导的索拉非尼耐药，采用透射电镜观察缺氧条件下SMMC-7721细胞有无耗竭的形态变化。我们的结果表明基因敲除增加了自噬体的数量（图 3A）。为了进一步证实这一现象，我们测量了自噬中的生物标志物 LC3 的脂质水平。结果表明，基因敲除显着增加了肝癌细胞系中LC3-II的积累（图3B-D）。LC3-II 在索拉非尼抗性 HepG-2 细胞中的积累也有所增强，与亲本细胞相比，其表达相对较低（图 3E）。值得注意的是，我们通过荧光免疫染色检测到敲除的肝癌细胞和索拉非尼耐药的 HepG-2 细胞中 GFP-LC3 的亚细胞重新分布增加。拯救野生型减少了这些细胞中 GFP-LC3 的积累（图 3F-H）。为了探索自噬在缺失引起的索拉非尼耐药中的作用，我们测量了 IC50。3-MA处理降低了基因敲除介导的LC3-II的积累（图3I-K），使3-MA处理组索拉非尼的IC50显着降低（图3L-N）。这些结果表明缺失增加了索拉非尼的自噬通量。拯救野生型减少了这些细胞中 GFP-LC3 的积累（图 3F-H）。为了探索自噬在缺失引起的索拉非尼耐药中的作用，我们测量了 IC50。3-MA处理降低了基因敲除介导的LC3-II的积累（图3I-K），使3-MA处理组索拉非尼的IC50显着降低（图3L-N）。这些结果表明缺失增加了索拉非尼的自噬通量。拯救野生型减少了这些细胞中 GFP-LC3 的积累（图 3F-H）。为了探索自噬在缺失引起的索拉非尼耐药中的作用，我们测量了 IC50。3-MA处理降低了基因敲除介导的LC3-II的积累（图3I-K），使3-MA处理组索拉非尼的IC50显着降低（图3L-N）。这些结果表明缺失增加了索拉非尼的自噬通量。

4.通过介导信号调控肝癌细胞自噬

我们探索了删除激活肝癌自噬的机制。基因集富集分析揭示了细胞对逆境的基因反应途径的富集。GSEA 中富集了 23 个具有显着变化的基因（图 4A）。KEGG分析表明它是一种通用转录因子。当它被击倒时，其自噬信号通路发生了显着变化（图 4B）。为了确定如何调控肝癌，我们首先测试了基因敲除后的表达水平。我们证实，在稳定的敲除细胞中，蛋白质和 RNA 水平显着下调（图 4C）。此外，在处理后，敲除细胞中 mRNA 的半衰期和蛋白质水平显着低于对照细胞（图 4D 和 E）。通过RNA基团分离，我们发现敲除显着降低了 40S 组件下的翻译效率（图 4F）。接下来，为了识别调节表达水平的潜在 m6A 阅读器，我们在 Bel-7402 细胞中敲除和（图 4G）。敲除消除了过度表达 Bel-7402 的细胞中蛋白质水平的增加（图 4H）。反过来，删除显着降低了 RNA 表达水平（图 4I），表明 m6A 修饰可能参与了表达的调节。

为了证明 m6A 调节对介导表达的影响，我们将 3'UTR 克隆到双荧光素酶报告结构中以生成 3'UTR 的突变形式（图 4K）。在不同浓度的 Bel-7402 细胞中测量了野生型和突变体 3'UTR 的相对标准化荧光素酶活性。在敲除和敲除细胞中检测到野生型荧光素酶活性降低。相反，对于 3'UTR 突变形式，或删除没有影响（图 4L）。在过表达细胞中，删除消除了荧光素酶活性的野生型诱导（图 4L）。此外，为了验证缺氧条件下介导的m6A修饰的真实靶点，我们进行了m6A RNA免疫沉淀分析（）和-RIP分析，并通过RT-PCR进行了分析。敲除显着降低了 mRNA 的 m6A 水平（图 4M）并降低了与 mRNA 的结合（图 4N）。此外，通过对肝脏肿瘤数据集的分析，我们发现在mRNA水平上，与（图4O）和与（图4P）存在显着的正相关。总之，我们已经证实它是 m6A 介导的肝癌修饰的关键靶点。

5. 过表达通过抑制自噬来挽救肝癌 m6A 依赖性索拉非尼敏感性

为了研究自噬信号通路中直接靶标之间的连通性，我们分析了由强力霉素诱导的两个数据库。自噬下调基因表达谱中的过度表达，而在 SMMC-7721 细胞中，敲除诱导自噬相关基因的转录（图 5A）。与下调一致，它在索拉非尼抗性 HepG-2 细胞中显着下调（图 5B）。敲除可以增加肝癌细胞系的自噬活性（图 5C）。为了确定它是否在依赖性自噬中起关键作用，我们过度表达。结果表明，敲除细胞中的过表达降低了自噬活性（图 5E），减少了自噬体的数量（图 5F），并延迟了 GFP-LC3 的亚细胞重新分布（图 5G）。相似地，索拉非尼抗性 HepG-2 细胞中的荧光免疫染色过表达显示相同的结果（图 5H）。我们还发现过表达显着影响了 m6A 介导的耐药肝癌细胞对索拉非尼的治疗（图 5I-L）。总之，这些结果表明耗竭介导的索拉非尼耐药在肝癌中起着关键作用。

6.体内缺失通路/轴显着增强索拉非尼耐药性

为了验证索拉非尼在肝癌进展中的作用，我们建立了同种异体移植小鼠模型并给药：DMSO和索拉非尼（50 mg/kg/2天，腹腔注射））。与我们之前的体外实验结果一致，随着肿瘤大小和肿瘤重量的增加，基因敲除显着消除了索拉非尼体内治疗的抑制作用（图6A-C）。此外，我们将Bel-7402细胞直接注射到NOD-SCID小鼠的肝实质中，建立了原位移植肝癌模型。与对照组相比，基因敲除消除了索拉非尼对肝肿瘤微环境的抗肿瘤作用（图 6D 和 E）。为了进一步证实/axis在体内肝癌中的作用，我们构建了一个同种异体移植小鼠模型并像以前一样开始给药。一致地，索拉非尼的敲除显着消除了索拉非尼在体内的抑制作用。值得注意的是，敲除 6 细胞的过度表达挽救了索拉非尼的敏感性效应，这反映在与溶剂处理组相比肿瘤大小和肿瘤重量显着减少（图 6F-H）。与单次使用相比，索拉非尼处理的敲除细胞中的过表达显示增殖、自噬和血管生成减少（图 6I-L）。这反映在与溶剂处理组相比，肿瘤大小和肿瘤重量显着减少（图 6F-H）。与单次使用相比，索拉非尼处理的敲除细胞中的过表达显示增殖、自噬和血管生成减少（图 6I-L）。这反映在与溶剂处理组相比，肿瘤大小和肿瘤重量显着减少（图 6F-H）。与单次使用相比，索拉非尼处理的敲除细胞中的过表达显示增殖、自噬和血管生成减少（图 6I-L）。

此外，我们在 BALB/C 裸鼠中建立了两个源自肝癌患者的异种移植 (PDX) 模型，并使用了四种给药方案（图 7A）。与索拉非尼治疗的对照组（图7B-D和I）相比，损失显着挽救了异种移植肿瘤的生长，后者分别表现为Ki67（图7F）、LC3-B（图7G）和VEGF-A (图 7H) 显示增殖、自噬和血管生成增加 (图 7E)。总之，我们得出结论，体内缺失主要通过 / 轴显着增强索拉非尼耐药性。

综上所述：

我们的工作揭示了介导的 m6A 修饰在缺氧肿瘤微环境中的关键作用，并确定 m6A 修饰是抗索拉非尼治疗肝癌的重要靶点。