单抗药物及其糖基化修饰工作报告(2016年10月21日)

45 () No. 11.issn.0253 Juan 3820.基于质谱技术的贝伐单抗及其糖基化修饰的表征、定量和药代动力学分析 1,2*1212 Cong Shao Hu Shao叶明邵顾靖凯 邹汉发 1（吉林大学生命科学学院，长春） 2（中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离与分析化学重点实验室，大连） 丙烯酰胺采用凝胶电泳技术和蛋白质组学策略对单克隆抗体药物及其糖基化修饰进行综合表征。共发现了 17 种糖型，并确定了特征肽序列。采用液相色谱-串联质谱技术，采用平行反应检测模式，通过测定单克隆抗体水解后产生的特征肽，实现大鼠血浆样品中单克隆抗体药物含量的绝对定量分析，得到不同给药方式. 测得的贝伐单抗药物浓度-时间曲线，同时实现了单克隆抗体糖基化修饰的相对定量分析。

本实验首先建立标准工作曲线对大鼠血浆样本2中的贝伐单抗进行定量分析。在线性范围内，相关系数R=0.998，定量限为66 fmol，线性关系很好。. 大鼠血浆样品测定结果显示，高、低剂量贝伐珠单抗药物的浓度-时间曲线趋势基本一致，浓度直接下降，符合理论趋势。但由于糖型的不同，大部分糖型都表现出浓度先升高，然后代谢不同的现象。关键词 ; 糖基化修饰；液相色谱-串联质谱法；平行反应监测；药代动力学是一类以免疫球蛋白G为结构基础的大分子蛋白药物，为治疗各种疾病提供了新途径。贝伐珠单抗是一种重组人源化单克隆抗体药物，可选择性结合人血管内皮生长因子（[3]，VEGF）并阻断其生物活性，用于治疗直肠癌。贝伐单抗药物序列已知，分子量约，其中轻链分子量约。作为一种复杂的大分子糖蛋白药物，单克隆抗体药物两条重链Fc片段第297位的天冬氨酸（编号）具有高度保守的N-糖基化修饰[4]位点。为各种疾病的治疗提供了新的途径。贝伐珠单抗是一种重组人源化单克隆抗体药物，可选择性结合人血管内皮生长因子（[3]，VEGF）并阻断其生物活性，用于治疗直肠癌。贝伐单抗药物序列已知，分子量约，其中轻链分子量约。作为一种复杂的大分子糖蛋白药物，单克隆抗体药物两条重链Fc片段第297位的天冬氨酸（编号）具有高度保守的N-糖基化修饰[4]位点。为各种疾病的治疗提供了新的途径。贝伐珠单抗是一种重组人源化单克隆抗体药物，可选择性结合人血管内皮生长因子（[3]，VEGF）并阻断其生物活性，用于治疗直肠癌。贝伐单抗药物序列已知，分子量约，其中轻链分子量约。作为一种复杂的大分子糖蛋白药物，单克隆抗体药物两条重链Fc片段第297位的天冬氨酸（编号）具有高度保守的N-糖基化修饰[4]位点。VEGF）并阻断其治疗直肠癌的生物活性。贝伐单抗药物序列已知，分子量约，其中轻链分子量约。作为一种复杂的大分子糖蛋白药物，单克隆抗体药物两条重链Fc片段第297位的天冬氨酸（编号）具有高度保守的N-糖基化修饰[4]位点。VEGF）并阻断其治疗直肠癌的生物活性。贝伐单抗药物序列已知，分子量约，其中轻链分子量约。作为一种复杂的大分子糖蛋白药物，单克隆抗体药物两条重链Fc片段第297位的天冬氨酸（编号）具有高度保守的N-糖基化修饰[4]位点。

N-糖基化修饰通常是复杂的双天线糖链结构，可能发生岩藻糖基化和唾液酸化。大量研究表明，单克隆抗体药物的N-糖基化修饰具有一定的稳定性、清除率、免疫原性、抗体依赖性细胞毒性（Jan，ADCC）和补体依赖性细胞毒性（Jan，CDC）。5][6]。例如，缺乏核心岩藻糖的糖型可以增强对 Fc 或 RIII 缺陷受体的亲和力，从而增加 ADCC；而高水平的唾液酸化糖型会降低对 Fc 或 RIII 缺陷受体的亲和力。，从而降低ADCC。因此，建立稳定可靠的分析方法对研究单克隆抗体及其糖基化修饰的药代动力学和药效学具有重要意义。蛋白质药物的传统药代动力学研究多采用酶联免疫吸附法（Jan[8,9]）。该技术虽然为蛋白质定量分析提供了一种简单、灵敏、高通量的方法，但仍存在许多局限性，如开发周期长、成本高、无法区分内源性干扰和交叉反应等。 用于研究关于翻译后修饰 [10,11]。

近年来，随着质谱技术的不断改进和发展，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）逐渐成为一种高灵敏度、高特异性、高通量、高通量的检测方法。蛋白质定量。性能良好的分析方法，其中多反应监测（MRM）技术通过两种离子选择大大降低了背景噪声，从而提高了分析方法的灵敏度和重现性，成为一种蛋白质定量方法。重要手段。此外，[13] MRM 方法在糖基化修饰的定量研究中也显示出很大的优势。等。建立了一种定量表征单克隆抗体药物 N-糖形式的方法，通过“ 能量依赖型冶炼氧离子监测模式，系统研究了质谱能量和N-糖链氧离子。2017-03-20 收到；2017-09-07 从国家自然科学基金接收本文。药代动力学分析中1679片段化的关系，实现了N-糖链的定量表征，糖肽的检出限为30 amol，线性范围可达4个数量级[14]。区分糖链的异构体。实现N-糖链的定量表征，糖肽的检测限为30 amol，线性范围可达4个数量级[14]。区分糖链的异构体。实现N-糖链的定量表征，糖肽的检测限为30 amol，线性范围可达4个数量级[14]。区分糖链的异构体。

本研究为单克隆抗体药物N-糖型的定量研究提供了新思路。洪等人。使用 MRM 策略同时对 IgG 蛋白及其 N-糖型进行绝对定量分析。IgG蛋白的检测限为60 amol，检测动态范围高达3个数量级。血清中26种高丰度N-糖肽直接测定，无需富集。近年来出现的四极杆-静电场轨道阱（Q-）高分辨率质谱仪提供了另一个类似于MRM的选择——平行反应监测（，PRM）模式。PRM和MRM的区别在于第三个四极杆被一个高分辨率、高质量的精密质量分析器所取代，它可以在一次分析中检测所有碎片离子，虽然PRM策略已成功应用于蛋白质定量研究[17,18]，但目前还没有将PRM策略用于单克隆抗体药物分析的相关报道。本研究基于PRM技术，建立了一种可同时分析单克隆抗体药物及其糖基化修饰的定性定量质谱分析方法，并将其应用于药代动力学研究。本研究为蛋白药物的药代动力学研究提供了新方法，为糖蛋白药物糖基化修饰研究提供了新思路，为药物开发和临床安全用药研究提供了新途径和理论基础。虽然PRM策略已成功应用于蛋白质定量研究[17,18]，但目前还没有将PRM策略用于单克隆抗体药物分析的相关报道。本研究基于PRM技术，建立了一种可同时分析单克隆抗体药物及其糖基化修饰的定性定量质谱分析方法，并将其应用于药代动力学研究。本研究为蛋白药物的药代动力学研究提供了新方法，为糖蛋白药物糖基化修饰研究提供了新思路，为药物开发和临床安全用药研究提供了新途径和理论基础。本研究基于PRM技术，建立了一种可同时分析单克隆抗体药物及其糖基化修饰的定性定量质谱分析方法，并将其应用于药代动力学研究。本研究为蛋白药物的药代动力学研究提供了新方法，为糖蛋白药物糖基化修饰研究提供了新思路，为药物开发和临床安全用药研究提供了新途径和理论基础。本研究基于PRM技术，建立了一种可同时分析单克隆抗体药物及其糖基化修饰的定性定量质谱分析方法，并将其应用于药代动力学研究。该研究为蛋白药物的药代动力学研究提供了新方法，为糖蛋白药物糖基化修饰研究提供了新思路，为药物研发和临床安全用药研究提供了新途径和理论基础。

2 实验部分2.1 仪器和试剂AB Juan TOF/TOF质谱仪（美国AB公司）；IEF Cell垂直电泳仪（美国Bio-Rid公司）；Q Juan质谱仪（美国公司），拥有纳米升级电喷雾离子源、2.1数据处理软件和超高效液相色谱系统；恒温振荡器、离心浓缩器（美国公司）；UMAX扫描仪（中国立光科技有限公司）。贝伐单抗（100 mg/4 mL）购自当地药房；稳定同位素标记的特征肽*（*显示为13 15 C同位素，N标记赖氨酸）购自北京中科亚光生物科技有限公司；肽糖苷酶 F（F，美国新公司）；尿素（尿素、加拿大生物公司）；乙腈（ACN， Pure，德国公司）；胰蛋白酶、二硫苏糖醇 (DTT)、碘乙烷酰胺 (IAA)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸 ()、过硫酸铵 (AP)、3,5-二甲氧基-4-4-羟基肉桂酸 (SA)、甲酸 (FA) 和三氟乙酸(TFA) 购自美国公司；四甲基乙二胺（美国公司）；还原SDS-PAGE试验缓冲液（5伊拉克）、40%丙烯酰胺溶液（美国公司）；考马斯亮蓝G250（美国Bio-Rad公司）；固相萃取柱（10mg，美国公司）；实验用水为超纯水Juan Q系统（美国公司）制备的超纯水。过硫酸铵（AP）、3,5-二甲氧基-4-4羟基肉桂酸（SA）、甲酸（FA）和三氟乙酸（TFA）购自美国公司；四甲基乙二胺（美国公司）；还原SDS-PAGE试验缓冲液（5伊拉克）、40%丙烯酰胺溶液（美国公司）；考马斯亮蓝G250（美国Bio-Rad公司）；固相萃取柱（10mg，美国公司）；实验用水为超纯水Juan Q系统（美国公司）制备的超纯水。过硫酸铵（AP）、3,5-二甲氧基-4-4羟基肉桂酸（SA）、甲酸（FA）和三氟乙酸（TFA）购自美国公司；四甲基乙二胺（美国公司）；还原SDS-PAGE试验缓冲液（5伊拉克）、40%丙烯酰胺溶液（美国公司）；考马斯亮蓝G250（美国Bio-Rad公司）；固相萃取柱（10mg，美国公司）；实验用水为超纯水Juan Q系统（美国公司）制备的超纯水。固相萃取柱（10mg，美国公司）；实验用水为超纯水Juan Q系统（美国公司）制备的超纯水。固相萃取柱（10mg，美国公司）；实验用水为超纯水Juan Q系统（美国公司）制备的超纯水。

2.2 色谱和质谱条件实验室自制毛细管C捕集柱（5 cm Yi 200 μm）；自制的带电喷雾针的C色谱柱（15 cm Yi 75 μm）；flow 1818 流动相 A : HO Juan FA (100 Yi 0.1,V/V); 流动相 B：ACN Juan HO Juan FA (80 Yi 20 Yi 0.1, V/V)；梯度洗脱：0 ~ 10 分钟，22 96% A；10 ~ 11 分钟，96% ~92% A；11 ~ 100 分钟，92% ~55% A；100～105分钟，55～10%A；105 ~ 113 分钟，10% A；113~115 分钟，10~96% A；115~130 分钟，96% A。流速：300 nL/分钟。正离子反应模式；平行反应监测模式；1 次全扫描加 10 次目标扫描为 1 个周期；全扫描扫描范围为6 m/z 400~2500，分辨率为，自动增益设置为1-10，最大进样时间为50 ms；目标扫描分离窗口为6×1，分辨率为，自动增益设置为1-10，最大进样时间为。质谱参数见表1。 2.3 数据处理酶解考察：使用1.3软件（美国公司）对Q娟采集生成的*.raw文件进行转换质谱仪成*.mgf文件，然后使用2.3.0搜索引擎（英国公司）进行数据库搜索，数据库为自建数据库，参数设置如下：质量公差母离子为10 ppm，碎片离子0.05 Da；肽段必须满足胰蛋白酶半酶切的限制，最多允许有两个漏切位点；半胱氨酸设置为固定修饰(Car-,57.0215); 甲硫胺酸设置为可变修饰（，15.9949 Da）；推导肽段p10的有效阈值，最终得到*.csv搜索结果文件。

糖基化修饰表征：使用上述方法通过贝伐珠单抗数据库检索去糖基化样品的*.raw文件得到*.csv文件，并添加天冬酰胺脱酰胺（，0.9840 Da）， 化学卷 45 1680 表 1 贝伐单抗特征肽、内标序列和糖基化位点所在的肽 *STYR 对应糖肽 PRM 模式 1 和 *STYR 和 (PRM) 母离子提取离子数糖类型/序列电荷的质谱条件碰撞能量数./ (%)(m/z)(m/z)................................. ....*526..4125 相同。

然后使用2.0 软件将*.csv 文件转换为*.ppl 文件。同时，将贝伐单抗酶切样品的*.raw文件转换为*.raw文件。文件通过MS软件。最后，将生成的 *.ppl 文件与 *.ppl 文件一起导入。文件进入软件进行自动搜索匹配，得到糖基化修饰结果。2.4 振荡给药方案和血浆样本采集 取两只雄性大鼠，体重（200依20) g，自由进食和饮水，分别按身高50和10 mg/kg） 低-剂量通过尾静脉推注给药。从大鼠眼眶静脉丛采血，按给药前（0 h）和给药后0.5、1、<@两组大鼠给药2、4、< @8、1<@2、 24、32 h 收集 1 mL 血液于肝素化 1. 5 mL 离心管中，4 以 1 r/min 离心 5 min，然后冷冻并储存在-80 Yi 进行测试。2.5 摇匀制备的贝伐珠单抗标准系列溶液和内标肽溶液 取适量贝伐单抗储备液（25 ozg/AIDS L），用水稀释得到贝伐单抗标准系列溶液，浓度为< @1.<@2、 1.0、0.5、0.1、0.04、 0.01 和 0.005 AIDS g/ AIDS L, Yu-20 Yi 保存以备后用。取适量内标肽储备液（5.

将上述获得的酶解产物进行固相萃取以去除盐等杂质，并使用 1.2 mL ACN-HO-TFA (80-20-)。0.1,V/V)溶液洗脱，收集洗脱液，离心，冻干。2 加入200 ozL0.1% FA 溶液复溶，得到标准曲线样品，取2 oz L 进样进行质谱分析。2.7 大鼠血浆样品的酶解 每个时间点取大鼠血浆样品4L，置于2mL离心管中，加入192L变性缓冲液（50%）。mmol/L，8mol/L尿素，pH8.0)， L 1mol/L DTT，涡旋混匀，60 Yi恒温振荡1小时。V/V)溶液洗脱，收集洗脱液，离心，冻干。2 加入200 ozL0.1% FA 溶液复溶，得到标准曲线样品，取2 oz L 进样进行质谱分析。2.7 大鼠血浆样品的酶解 每个时间点取大鼠血浆样品4L，置于2mL离心管中，加入192L变性缓冲液（50%）。mmol/L，8mol/L尿素，pH8.0)， L 1mol/L DTT，涡旋混匀，60 Yi恒温振荡1小时。V/V)溶液洗脱，收集洗脱液，离心，冻干。2 加入200 ozL0.1% FA 溶液复溶，得到标准曲线样品，取2 oz L 进样进行质谱分析。2.7 大鼠血浆样品的酶解 每个时间点取大鼠血浆样品4L，置于2mL离心管中，加入192L变性缓冲液（50%）。mmol/L，8mol/L尿素，pH8.0)， L 1mol/L DTT，涡旋混匀，60 Yi恒温振荡1小时。7 大鼠血浆样品酶解 各时间点取大鼠血浆样品4L，置于2mL离心管中，加入192L变性缓冲液（50%）。mmol/L，8mol/L尿素，pH8.0)， L 1mol/L DTT，涡旋混匀，60 Yi恒温振荡1小时。7 大鼠血浆样品酶解 各时间点取大鼠血浆样品4L，置于2mL离心管中，加入192L变性缓冲液（50%）。mmol/L，8mol/L尿素，pH8.0)， L 1mol/L DTT，涡旋混匀，60 Yi恒温振荡1小时。

其余步骤与上述相同。第11期丛玉婷等：基于质谱技术的贝伐单抗及其糖基化修饰的表征、定量和药代动力学分析 邵1681 3 结果与讨论3.1 邵单克隆抗体序列和糖基化分析基于蛋白质组学策略自上而下，充分表征了贝伐单抗及其糖基化修饰。首先，通过 Juan TOF MS 技术，在完整蛋白质水平上检测了贝伐单抗的分子量和糖基化修饰。如图1A所示，完整贝伐单抗蛋白的实测分子量约为150 kDa，与理论值一致。另外，谱图中的76 kDa峰为单克隆抗体的二价分子离子峰。去糖基化贝伐单抗蛋白的测量结果如图 1B 所示。测得的去糖基化贝伐珠单抗蛋白分子量约为147 kDa，与理论值一致。在图1B中，在74 kDa处也有一个峰，这也是单克隆抗体的二价离子峰。去糖基化的蛋白质和片段的分子量比以往未糖基化的蛋白质和片段的分子量低2～4kDa，这与单克隆抗体药物的几种糖基化糖基化的分子量一致[5,13,​​19]。.67 19）A% .2500 (y / z) 100 ..7031% 80 (y / z 图 1 贝伐单抗的光谱 (A) 完整的贝伐单抗；(B) 去糖基化的贝伐单抗 图 1 的 TOF-MS (A)和(B)同时，采用SDS-PAGE技术，

在对完整蛋白质的表征中，为了保持蛋白质的完整性，采用变性非还原性SDS-PAGE进行考察，即选用非还原性上样缓冲液；当对轻链和重链进行表征时，选择还原加载缓冲液，缓冲液中的二硫键被 DTT 打开。SDS-PAGE电泳结果见图MA BC D 2。A和B是基于变性非还原电泳及其去糖基化带的完整。仔细观察可以发现A条带比B条带稍宽，这主要是由于糖基化修饰（70aD）引起的微观异质性。此外，波段 B 略微依赖于 k( 55