【中信期货】第一部分基础研究刘辉-孙婷婷2

基础研究的第一部分是贝伐珠单抗逆转鼻咽癌耐药的实验研究刘慧1罗荣成1孙婷婷2杨小敏1作者单位1广州南方医院肿瘤科邮编解放军骨科201医院邮编-摘要背景与目的药物耐受性是肿瘤化疗失败的最重要原因之一。抗血管生成是肿瘤治疗的新思路。已进行临床观察。贝伐单抗可以在一些化疗失败的复发/转移患者中恢复对化疗药物的敏感性。体外研究耐药性肿瘤细胞的作用，探索是否有逆转肿瘤细胞耐药性的方法。以低分化人鼻咽癌细胞系CNE2及其对吉西他滨耐药的细胞亚系CNE2/Gem为研究对象，体外以不同浓度和/或处理细胞用四甲基唑蓝MTT法检测药物对CNE2的杀伤作用和CNE2/Gem，用流式细胞仪测定CNE2和CNE2/Gem的凋亡率，用半定量RT-PCR检测药物治疗前后细胞中2Bax等基因表达水平的变化被使用。0 软件。方法分析不同处理组细胞杀伤率和凋亡率的差异。单次使用10ug/小时的结果 细胞杀伤率与空白对照组相近。差异无统计学意义。P0。140，浓度增加一倍，但杀灭率没有明显变化。PO 浓度组之间没有统计学上的显着差异。531 但无论是20ug/ml还是40ug/与10u∥联合使用，杀灭率均显着高于单独使用，差异有统计学意义P0。. 001 在相同药物处理条件下，CNE2/Gem细胞的早期凋亡率明显低于CNE2细胞。. 06%VS23。. 21% P0.005 晚期细胞凋亡率也下降 41. . 78% VS60。. CNE2/Gem细胞94% P0.036联合20ug/和10u∥处理24h,处理诱导的早期凋亡率明显高于单纯39。. 85% VS8。. 06%铂。001 但晚期细胞凋亡率变化不大 37. . 11%VS41。. 78%P0. 582半定量RT-PCR法显示MDR1在/Gem和CNE2/Gem/Bev中的相对表达量分别为0.6231.364和1，分别为0.2411.652和1。一和二分别为0.6130.952和0.63，分别。分别为 0.6650.387 和 1.751。结论可显着提高人鼻咽癌吉西他滨耐药细胞系CNE2/Gem对CNE2/Gem细胞毒性的敏感性。与亲本细胞CNE2相比，增加浓度并没有增加耐药细胞CNE2/Gem的杀伤率，早期凋亡细胞明显减少，但可以增加耐药细胞的早期凋亡，对耐药细胞影响不大。耐药相关基因，但可显着影响凋亡相关基因表达促进耐药细胞凋亡关键词鼻咽癌CNE2细胞系吉西他滨耐药贝伐单抗凋亡鼻咽癌是中国广东常见的肿瘤之一放疗联合化疗是目前主要的治疗方法大多数晚期患者因化疗失败而死亡。这主要是由于癌细胞中产生了多药耐药性。长期以来，肿瘤学家一直在努力寻找逆转肿瘤细胞耐药性的方法，但效果并不理想[1 抗血管生成是肿瘤治疗的新思路。针对VEGF的单克隆抗体每年都被美国FDA批准用于晚期结直肠癌的一线治疗。对联合化疗建立的生物化疗模型的有效性进行了临床观察。不仅远胜于单独化疗或两者兼而有之，尤其是对于一些复发/转移患者，使用分子靶向药物恢复敏感性2后一直无效的化疗药物似乎是EIJI。HINA的抗肿瘤作用除了抑制肿瘤血管生成外，还包括增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，而后者很可能是通过逆转肿瘤细胞的耐药性来实现的。本研究首先以表达阳性VEGF的人鼻咽部低分化鳞状细胞系CNE2及其对吉西他滨耐药的细胞亚系CNE2/Gem为研究对象。采用不同浓度或联合处理的体外MTT法测定不同药物引起的细胞杀伤强度。流式细胞术检测凋亡半定量RT-PCR方法检测细胞中2Bax等基因表达的变化 1 材料与方法 1.1 细胞系。药物与试剂 人鼻咽癌细胞系CNE2低分化由军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物学科提供。本实验室将其抗吉西他滨细胞亚系CNE2/Gem在含10%/J牛血清和高糖的DMEM中诱导培养。基础培养条件为37C5%CO2饱和湿度培养箱，含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA。消化传代药物包括盐酸吉西他滨。Eli 和 试剂包括高糖 DMEM 培养基。犊牛血清 兰州民海生物公司 胰蛋白酶 上海化学试剂公司 二甲基四唑蓝公司 二甲基亚砜公司-FITC 凋亡试剂盒 南京凯基公司 反应系统 广州大汇公司等 1.2 方法 1 ．2.1 贝伐单抗处理的细胞 CNE2/Gem 细胞 添加终浓度 10ug /ml 每 4 天加入培养基并每 4 天传递一次。通过连续传代4代获得细胞。将 Gem 细胞接种在 96 孔板中，每孔细胞密度为 /ml。根据表1的实验设计，加入一定浓度的I结构，置于37C5%CO2饱和湿度培养箱中培养72小时。每孔加入 5mg/ml，孵育 4 小时。通过在室温下摇动以溶解晶体，将上清液添加到每个孔中。使用酶标仪测量对照组的吸光度 OD 值。取6孔OD值的平均值。成活率是药物每个孔的杀伤率。杀灭率用公式1表示。 实验组各孔OD值/对照组平均OD值% 1.2.3 流式细胞术检测吉西他滨联合贝伐珠单抗引起的细胞凋亡 CNE2和CNE2/Gem细胞常规培养于50ml培养瓶观察细胞贴壁生长。取2瓶CNE2细胞和3瓶CNE2/Gem细胞参加实验。1瓶CNE2和1瓶CNE2/Gem以20ug/ml的浓度加入。加入一瓶CNE2/Gem，浓度分别为20ug/ml和10ug/ml，另外一瓶CNE2和一瓶CNE2/Gem作为对照。将 5 瓶细胞置于 %CO2 饱和湿度培养箱中 24 小时。通过离心消化和转移细胞。

Orf管用PBS溶液洗涤两次，细胞缓冲液悬浮细胞//FITC和碘化丙啶溶液PI双染混匀，室温孵育避光。弃去上清液，用 PBS 溶液洗涤一次，避光。FCM流式细胞仪检测 每个烧瓶细胞凋亡实验重复3次。1.2.4 半定量RT-PCR检测//Gem/Bev cell-2Bax mRNA表达水平所有引物均来源于。0 软件设计：广州大汇生物公司合成的引物序列见表3。取对数生长期//Gem/Bev细胞，按照试剂盒说明书消化提取RNA。逆转录条件为37℃恒温1h，然后95℃3min灭活PCR反应。条件预变性，然后94℃运行35个循环，最后72℃保存。反应结束后，取5ul PCR反应液，与第一部分基础研究充分混合。凝胶电泳仪进行电泳，出口电压为120伏，将出口电压调至60伏。2 以Bax的目的mRNA与内参PCR产物的光密度值之比作为目的mRNA的相对表达量。1.2.5 实验结果按平均标准篮球课程标准党员活动室建设尘肺病标准片儿科分级护理标准分级护理细化标准差表示采用。0 用于比较多个样本平均值和样本平均值之间的多重比较的软件方法。LSD法分析不同处理方法间细胞凋亡的差异。Plt0.05 具有统计学意义。2 结果 2.1 MTT法检测吉西他滨联合Beva 单克隆抗体的细胞杀伤作用不同浓度组合对CNE2/Gem。细胞杀伤效果结果见表1。方法分析表明，各实验组细胞杀伤效果差异有统计学意义。第4组和第5组在第4组和第6组之间的差异无统计学意义，只是两组之间的差异有统计学意义。单独10ug/小时的杀灭率与对照组相近。两组之间没有差异。P0.140 有统计学意义，浓度增加一倍，但杀灭率无明显变化。高浓度和低浓度之间没有统计学上的显着差异。差异在统计学上显着 P0。. 001 同时对于相同浓度，当浓度从10ug/ml增加到1]20ug/ml时，杀灭率没有明显变化。差异无统计学意义。P0.591 表 1 不同浓度吉西他滨联合贝类 对 CNE2/GemI]] 细胞的杀伤作用 Tab. /Mns% 于毅直立垂坠式 毅剑式堡垒 12 一个。. 60.. . 1065.. . 2067.. -634。. . . 5&. . 1古。. . . . . ----0。. --0. . arml&P--O。. arm3茅草PO。. . . . 3吉西他滨联合贝伐珠单抗诱导cNE2和cNE2/Gem细胞凋亡，与对照细胞相比，20ug/或联合10ug/24h处理后CNE2和CNE2/Gem细胞早期凋亡率增加23.21%VS。512%8.66%VS。4. 7l% 39.46% VS。4. 71% FITC和PI高染区晚期凋亡和继发性坏死细胞显着增加50.48% VS。3.1% 48.21% 对比。2.542.68% vs. 2. 5%，FITC和PI低染区活细胞显着减少24.45% VS。92.26% 40.56% 对比。82.3715.36% VS。82.37% 图2也显示20ug/治疗/Gem细胞的早期凋亡率明显低于CNE2细胞。. 06%VS。23. 50 塑料 BEU 婴儿 ING 监护仪 CH Tang-o 埘●＼ 7lB ■差异有统计学意义。晚期凋亡率 4170-978%% 差异也有统计学意义 P期凋亡明显高于单纯凋亡。85%%。该差异具有统一的学术意义，晚期凋亡不太快-51%。78% 的差异没有统计学意义。图 2 吉西他滨联合贝伐单抗诱导 CNE2 和 CNE2/Gom 细胞凋亡 [eCNF. 2/...细胞和其他30个器官中的mRNA表达，如细胞和其他mRNA的表达。从固体可以看出，内部控制具有良好的稳定性。目标基因条带显示差异图。软件分析确定每个条带的光密度以反映 //Gem/Bev3 细胞类型中其他四个基因的 mRNA 表达的光密度值。OD计算相对表达相对表达靶基因OD值内参OD值对亲本CNE2细胞在同月]诱导其耐药，然后对耐药细胞进行处理。MDRI 的表达首先显着上调，然后轻微 T 调节。调整然后显着减少。Bax 的表达首先下调，然后显着上调。一位 CTO。-G。33r OD计算相对表达相对表达靶基因OD值内参OD值对亲本CNE2细胞在同月]诱导其耐药，然后对耐药细胞进行处理。MDRI 的表达首先显着上调，然后轻微 T 调节。调整然后显着减少。Bax 的表达首先下调，然后显着上调。一位 CTO。-G。33r OD计算相对表达相对表达靶基因OD值内参OD值对亲本CNE2细胞在同月]诱导其耐药，然后对耐药细胞进行处理。MDRI 的表达首先显着上调，然后轻微 T 调节。调整然后显着减少。Bax 的表达首先下调，然后显着上调。一位 CTO。-G。33r

CTGC。呸。. 一个 o-not ℃ C ■ 337-■-GATC。-TcG-5 图片Ge网格cv单元。2 Bax 基因mRN 表达水平-Pa em zhi / Gem // 帕奇杰i xiao 31 Jia_/柙mock Ⅻ 7 其中音二1 汤盘小斋圊。CNE2//MDRI的Gem He Qi。血管内皮生长因子。Bcl-2。Bax基因rr A相对表达水平Bcl-Xiu／／Gom／／Gpa／结论 体外排除血管因素，抗VEGF单克隆抗体可显着增加人鼻咽癌耐药吉西他滨细胞系巨敏生的CNE2/Gem对。这种效果很可能是通过诱导耐药细胞凋亡来实现的。b...ab杀灭效果不明显，联合使用可显着提高细胞杀灭活性，但增加浓度并未增加耐药细胞CNE2/Gam的杀伤率，其与早期凋亡细胞相比，亲本细胞CNE2明显减少。可增加耐药细胞的早期凋亡，对耐药相关基因影响不大，但可显着影响凋亡相关基因的表达。促进耐药细胞凋亡 4 讨论 联合化疗在结直肠癌中的显着效果，使人们对抗血管生成药物和化疗药物在肿瘤治疗中的协同作用产生了兴趣。其抗肿瘤血管生成作用无疑是个大数目。体外和临床实验证实，本实验从另外十个角度研究的抗肿瘤作用是逆转肿瘤细胞耐药的作用或提高耐药肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用。Gem的杀伤作用明显强于单次使用，即iⅪ确实可以增加耐药细胞对化疗药物的敏感性，起到逆转耐药的作用。这是体外实验的结果。显然，它不能用抗血管生成作用来解释。必须有其他的作用机制。进一步研究发现，对耐药细胞的作用不是改变耐药基因的表达。MDRI在耐药细胞处理前后均无明显变化，但影响细胞凋亡相关基因的表达以诱导亲本CNE2细胞的耐药性。然后使用治疗耐药细胞。耐药细胞中凋亡抑制基因的表达先上调后显着下调。Bax基因促凋亡基因的表达先下调后显着上调。这种变化与细胞杀伤作用和细胞凋亡率的变化有关。变化是一致的。] 肿瘤细胞耐药的机制相当复杂，通过上调细胞凋亡机制来实现对耐药肿瘤细胞的协同杀伤。目前研究最多的是MDR-I基因，以爱该基因编码的大肠杆菌。谷胱甘肽GSH解毒酶系统中DNA拓扑异构酶的含量或性质，但根据发展参考文献1. . s。4261-4274.2。主编罗荣成_月中肿瘤生物治疗[M. 北京人民医学出版社. 3. 罗荣成、韩焕兴主编。肿瘤综合诊疗新进展第2版M]．北京人民军医出版社. 4. . . . . . 5. . . . -844.6 林文和李德瑞。鼻咽癌多药耐药的研究现状[J]. 中国癌症。萌友 肿瘤综合诊疗新进展第2版M]．北京人民军医出版社. 4. . . . . . 5. . . . -844.6 林文和李德瑞。鼻咽癌多药耐药的研究现状[J]. 中国癌症。萌友 肿瘤综合诊疗新进展第2版M]．北京人民军医出版社. 4. . . . . . 5. . . . -844.6 林文和李德瑞。鼻咽癌多药耐药的研究现状[J]. 中国癌症。萌友