靶向肿瘤血管可以达到“饿死”肿瘤的治疗效果[]

肿瘤血管为肿瘤提供氧气、营养和扩散通道。靶向肿瘤血管可达到“饿死”肿瘤的治疗效果[]。贝伐珠单抗（BEV）可以特异性靶向血管内皮生长因子VEGF-A，抑制血管生成和肿瘤生长[]。然而，肿瘤血管生成涉及多种蛋白质或信号通路。单一靶点药物抑制某种蛋白质后，血管生成往往具有现代代偿现象，进而引起肿瘤反弹生长、转移和耐药[]。贝伐单抗在临床使用时，往往需要与其他抗肿瘤药物联合使用，以提高其对肿瘤的抑制作用。

自噬可以通过降解受损的细胞器、细胞质和入侵细胞内的微生物来维持肿瘤稳态。因此，抑制自噬可以阻断肿瘤进展[]。抗疟药羟氯喹(HCQ)可以抑制自噬体和溶酶体的融合和降解，从而抑制自噬[]。羟氯喹目前主要用于治疗风湿免疫疾病。近年来，其抗肿瘤作用逐渐显现[]。然而，羟氯喹的抗肿瘤机制非常复杂。目前报道的作用机制包括：抑制自噬、影响溶酶体功能、调节免疫、抑制炎症反应、影响内体功能、诱导细胞凋亡、增强致敏等。化疗等。

研究表明，贝伐珠单抗与羟氯喹联合使用可协同抑制多种肿瘤的生长[]。但羟氯喹与贝伐珠单抗联用对肿瘤血管的作用及机制尚不清楚。由于人脐静脉内皮细胞（vein ）在血管生成过程中起重要作用，常用于肿瘤血管生成实验，本实验拟采用实时无标记细胞分析技术（real time，RTCA）和Flow细胞学检测细胞凋亡，分别研究羟氯喹和贝伐单抗对细胞增殖和凋亡的影响，然后用体外血管新生实验研究羟氯喹和贝伐单抗对细胞血管新生的影响。此外，本实验拟通过blot检测LC3、p62蛋白的表达，电镜观察自噬体和线粒体的变化，并利用转录组测序（RNA-seq）进一步阐明羟氯喹与贝伐单抗的组合。协同抑制细胞生长的机制。

1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞

人脐静脉内皮细胞购自美国实验室。

1.1.2 药品和试剂

凝胶（BD公司）；RPMI 1640 中 (); 贝伐单抗（罗氏）；羟氯喹 (-); LC3 抗体（细胞）；p62抗体（公司）；V-FITC 套件 (); RTCA S16（艾森生物）；RTCA板（ Bio）；胰蛋白酶，胎牛血清（）。

1.1.3 仪器

激光扫描共聚焦显微镜（）；H-7650透射电子显微镜（日立）；流式细胞仪 (); RTCA S16 (ACEA)。

1.2方法1.2.1个RTCA实验

首先，将 50 μL 介质添加到 E 板的孔中，并将其放置在 RTCA 上。RTCA 自动扫描并开始检测基线以确认所选孔处于正常接触状态。等待所有孔的基线在 40 到 120 之间后，取出 E 板，向孔中加入 100 μL 细胞悬液（3,000 个细胞/孔）[]。随后，羟氯喹（5 mg·L-1)、贝伐珠单抗（100 mg·L-1)）、羟氯喹（5 mg·L-1)与贝伐克单抗（100 mg· L-1). 将E-放在细胞培养箱中的RTCA上，系统会检测细胞值[]。

1.2.2 流式细胞凋亡实验

对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，离心，收集细胞。将细胞(2.5×108·L-1)接种到6孔板中，将细胞培养板置于培养箱中过夜。加入羟氯喹(5 mg·L-1)@ ) >, 贝伐珠单抗 (100 mg·L-1), 羟氯喹 (5 mg·L-1) 联合贝伐珠单抗 (100 mg·L-1)), 48 h 后收集细胞. 1×PBS洗涤后，离心收集细胞，加入300 μL 1×重悬细胞，然后加入5 μL V-FITC至细胞悬液，混匀，室温避光孵育20 min . 最后加入5 μL PI，混匀，室温避光孵育5 min，加入200 μL 1×，进行流式检测。

1.2.3 血管结构形成实验

对数期细胞离心，然后将细胞（6.0×106·L-1)）加入预先铺有的96孔板中，加入不同浓度的培养12小时后，显微镜下观察各组细胞并用软件拍照（×100)分析各组细胞的血管新生能力[].

1.2.检测p62、LC3的表达

混合添加到膜表面，转移到凝胶成像分析仪，以化学光敏模式曝光显影。照片以TIF格式导出后，在[-]软件下分析各波段的光密度。

1.2.5 透射电镜观察细胞超微结构

将羟氯喹（5 mg·L-1)、贝伐单抗（100 mg·L-1)）、羟氯喹（5 mg·L-1) 与贝伐单抗（100 mg·L- 1)处理后的细胞样品用细胞刮刀刮下，PBS洗3次，加入2.5%戊二醇，4℃过夜，透射电镜观察细胞超微结构改变。

1.2.6 LC3双荧光质粒转染观察自噬实验

取对数生长期细胞，胰酶消化后，800 r·min-1离心5 min，在计数板上计数，调整细胞密度至1×107·L-1，铺在24孔板上，并滑动它。每孔加入 1 mL，放入培养箱静置过夜。d 2 换1% FBS培养基继续培养，转入-EGFP-LC3红绿双荧光质粒，d 3 加入羟氯喹（5 mg·L-1)、羟氯喹（5 mg·L-1)结合贝伐单抗（100 mg·L-1)，24小时后，多聚甲醛固定15分钟，荧光显微镜下拍照分析。

1.2.7 RNA-seq测序

本实验首先提取各组细胞的总RNA，经过质检、mRNA的分选纯化、片段化、第一链cDNA的合成、二- cDNA等。在3'端加“A”进行反应。然后根据操作流程加入连接缓冲液和双链测序接头，使用T4 DNA连接酶将测序接头连接到文库DNA的两端。核酸片段筛选试剂盒用于在纯化文库的同时筛选片段的大小。然后使用PCR扩增DNA文库，在检查文库质量后，利用平台以2×150 bp双端测序模式进行高通量测序，获取数据。

1.2.8 统计分析

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，数据以x±s表示。组间统计分析采用't检验。

2 结果2.1 羟氯喹与贝伐单抗联合使用可协同抑制细胞增殖

使用 RTCA 实验检测每组细胞的 Cell 值。结果显示，与空白对照组相比，羟氯喹和贝伐珠单抗组细胞的Cell值均降低，提示羟氯喹和贝伐珠单抗均具有抑制细胞增殖的作用。与单药组相比，羟氯喹与贝伐珠单抗联合给药的细胞值更低，抑制作用更强（）。

图1 on and of by HCQ with BEV(x±s, n=3)A: by HCQ, BEV, and HCQ with BEV的cell；B: by HCQ, BEV, and HCQ with BEV的cell ; C:by flow. *P

2.2 羟氯喹与贝伐单抗联合使用协同促进细胞凋亡

使用V-FITC流式细胞术发现羟氯喹（5 mg·L-1)和贝伐珠单抗（100 mg·L-1)）可显着促进细胞凋亡，而羟氯喹与贝伐单抗联合使用后，细胞凋亡比例增加，提示羟氯喹与贝伐单抗联用可协同促进细胞凋亡（，）。

2.3 羟氯喹和贝伐珠单抗联合使用在体外协同抑制血管结构的形成

如图所示，羟氯喹（5 mg·L-1)和贝伐单抗（100 mg·L-1)）在体外可抑制血管结构的形成，当贝伐单抗和羟氯喹联合使用后，抑制作用血管结构形成的作用更为明显，实验结果表明，羟氯喹与贝伐珠单抗联合使用可协同抑制体外血管结构的形成。

图 2 上的 HCQ 和 BEV（bar=10 μm）

2.4 羟氯喹可抑制自噬

LC3主要以细胞质和膜结合两种状态存在，一种是LC3-I的弥散细胞质状态，另一种是LC3-II的膜结合状态。在自噬诱导过程中，LC3-Ⅰ的C端在ATG4/ATG7/ATG3等酶的作用下被磷脂酰乙醇胺（，PE）修饰，转化为LC3-Ⅱ。因此，LC3-II是目前常用的自噬标志物。此外，细胞内p62含量的变化也能反映自噬水平的抑制或诱导，因为p62既是自噬受体，又是可降解的自噬底物。

本实验采用blot检测内源性LC3-Ⅱ的变化，辅助检测p62水平，进而检测自噬。研究结果表明，羟氯喹（5mg·L-1)组）细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显着升高，p62蛋白的表达也增加。Ⅱ的降解受到抑制，p62的降解减少。但贝伐珠单抗（100 mg·L-1)不影响LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62蛋白的表达，羟氯喹和贝伐珠单抗对LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达无显着影响，以及抗结合组和羟氯喹单药组之间的p62蛋白（）。

图 3 HCQ 中 p62 和 LC3 的 BEV(x±s, n=3)**P

-EGFP-LC3双荧光标记可通过颜色变化判断自噬水平。本实验中羟氯喹可使细胞内LC3产生点状聚集，羟氯喹与贝伐珠单抗联合组与羟氯喹单药组相比无明显变化。

图 4 -EGFP-LC3 中 BEV 开启的 HCQ (bar=1 μm)

2.5 电镜观察自噬体和线粒体自噬

如图，电镜细胞形态观察（低倍）：正常细胞核大，形状规则，细胞触须生长正常。贝伐珠单抗组细胞质中出现一些空泡，细胞核聚集；羟氯喹治疗组细胞核聚集、萎缩、染色质聚集，细胞质减少，细胞触角明显减少。贝伐单抗和羟氯喹 羟氯喹和贝伐单抗治疗后，氯喹联合治疗组的细胞也出现了。

图 5 HCQ 与 BEV 开启和关闭 (bar=1 μm)

自噬体电镜观察（高倍）：正常细胞可见少量自噬体，贝伐珠单抗治疗组与对照组无显着差异。羟氯喹治疗组细胞内出现大量双膜囊泡，可见新月形或杯形双膜或多层膜结构，并有包围细胞质成分的趋势，提示线粒体自噬现象。自噬体在联合治疗组和羟氯喹治疗组中的表达相似。

线粒体电镜观察（高倍）：正常细胞线粒体数量和形态正常，贝伐珠单抗治疗组粗面内质网和线粒体肿胀。羟氯喹治疗组细胞的额外线粒体室明显肿胀和退化。贝伐珠单抗与羟氯喹联合治疗组细胞线粒体损伤更为明显，线粒体肿胀退化，部分线粒体形成液泡样结构或被液泡包围。

以上结果说明羟氯喹抑制自噬，自噬体未能与溶酶体融合降解，完成自噬过程。此外，贝伐珠单抗和羟氯喹均能损伤细胞线粒体，药物联合可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

2.6 转录组测序，发现羟氯喹和贝伐单抗协同抑制的可能机制

对差异表达大于2倍的基因进行统计，如图所示，与空白对照组相比，贝伐珠单抗组有1801个基因下调，23个基因上调。羟氯喹组有3 774个基因下调，950个基因下调。为研究羟氯喹与贝伐珠单抗联合应用的协同抗肿瘤机制，我们比较了羟氯喹或贝伐珠单抗单药组与联合用药组的差异表达基因，发现：与贝伐单抗组相比，在联合组2 096个基因表达上调，945个基因表达下调。与羟氯喹组相比，联合组有80个基因上调，36个基因下调。其中，共有69个差异表达基因（，）。KEGG信号通路分析显示，这些差异表达基因主要富集磷酸肌醇代谢()、RNA转运(RNA)等代谢过程，以及肿瘤相关的MAPK、ErbB、Ras、HIF-1、FoxO信号此外，该通路在EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、铂类耐药、内分泌耐药的过程中也富集。最后，通过蛋白质网络分析发现，羟氯喹与贝伐珠单抗的联合作用可能主要受到调控（对雷帕霉素不敏感的哺乳动物靶蛋白伴侣蛋白的），其他“hub”基因被协同抑制细胞（）。

图 6 的 HCQ 与 BEV 在：的；B：维恩的；C：的；D：KEGG的；E：HCQ 与 BEV 的“枢纽”基因。

3 讨论

在肿瘤血管生成过程中，血管内皮生长因子（VEGF）与其受体结合产生的激活信号起着至关重要的作用。贝伐珠单抗是一种人源化重组单克隆抗体，可以特异性靶向VEGF-A并阻止其结合，从而抑制血管生成。目前已获批用于治疗结直肠癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾细胞癌和转移性胶质瘤。但无论是化疗还是靶向治疗，都能诱导肿瘤细胞产生自噬，从而帮助肿瘤细胞耐受抗肿瘤药物带来的恶劣代谢环境，从而生存并产生耐药性。研究表明，贝伐单抗可诱导胶质瘤细胞发生自噬[]。

羟氯喹不仅是一种溶酶体抑制剂，可以阻断自噬过程，引起自噬体和LC3Ⅱ[]的明显积累，而且还具有抗肿瘤活性，还可以促进血管正常化，增加抗血管药物的治疗作用羟氯喹的抗肿瘤机制是非常复杂的，尚未研究清楚。血管内皮细胞在血管生成中也起着关键作用，常用于肿瘤血管生成实验。因此，本研究重点阐明羟氯喹联合贝伐珠单抗对细胞生长的影响和机制。

本研究发现，羟氯喹和贝伐单抗均能抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，减少血管结构的形成。与单药组相比，羟氯喹与贝伐单抗联用可协同抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制细胞血管结构的形成。此外，我们发现羟氯喹可以提高LC3-Ⅱ/LC3-I比值和p62蛋白水平，说明羟氯喹抑制自噬后期，从而抑制LC3-Ⅱ降解，降低p62蛋白水平。降解。-EGFP-LC3双荧光标记和电镜自噬体观察也证实羟氯喹可以抑制自噬。抑制自噬可能是羟氯喹和贝伐单抗抑制细胞的机制之一。电镜结果还发现，贝伐珠单抗与羟氯喹联合治疗时细胞线粒体损伤更为明显，线粒体肿胀退化，部分线粒体形成液泡状结构或被液泡包围。为了进一步阐明贝伐单抗和羟氯喹联合抑制细胞的机制，我们还采用了转录组测序的方法。通过对实验结果的分析，发现羟氯喹比贝伐单抗引起更多的差异表达基因。羟氯喹和贝伐单抗的组合产生了 69 个差异表达基因，主要富集磷酸肌醇代谢、RNA转运、肿瘤相关信号通路（如MAPK、ErbB、Ras、HIF-1、FoxO信号通路等），以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、铂类抵抗、内分泌抵抗等过程。蛋白质网络图的结果表明，羟氯喹和贝伐单抗的组合可能通过调控和其他“枢纽”基因对抑制细胞发挥协同作用。研究表明，肿瘤的发生发展和肿瘤细胞自噬与PI3K/Akt/mTOR[]密切相关。众所周知，mTOR是一种PI3K相关激酶，可通过mTOR信号复合物1()和mTOR信号复合物2()参与肿瘤细胞凋亡、循环和自噬等生物学过程。它也是 PI3K 的催化亚基。突变可以促进激酶活性，激活下游Akt，增加细胞侵袭和转移。是的，骨骼蛋白对其稳定性非常重要。它参与调节体内细胞的代谢、增殖、凋亡和自噬。例如，等。[]发现它可能影响VEGF、CD31和MMP-9的合成和分泌，从而调节肿瘤组织血管的形成，影响体内肿瘤细胞的转移。Xu等[]发现敲除可以抑制自噬。和体内细胞的自噬。例如，等。[]发现它可能影响VEGF、CD31和MMP-9的合成和分泌，从而调节肿瘤组织血管的形成，影响体内肿瘤细胞的转移。Xu等[]发现敲除可以抑制自噬。和体内细胞的自噬。例如，等。[]发现它可能影响VEGF、CD31和MMP-9的合成和分泌，从而调节肿瘤组织血管的形成，影响体内肿瘤细胞的转移。Xu等[]发现敲除可以抑制自噬。

综上所述，本研究发现羟氯喹与贝伐珠单抗联合使用具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞血管结构形成的协同作用，提示羟氯喹与贝伐珠单抗联合使用可能是一种可靠的治疗方法。抑制肿瘤血管的策略。此外，本研究还发现，羟氯喹联合贝伐珠单抗抑制肿瘤血管的机制不仅与羟氯喹抑制自噬有关，还可能与羟氯喹等“枢纽”基因的调控有关。