肿瘤细胞DNA抑制和逆转TKI耐药的值得探讨！！

【摘要】目的：肺癌是人类最常见的恶性肿瘤，其中80%-85%为非小细胞肺癌（非小细胞肺癌）。最常见的治疗方法是手术切除，辅以放疗和化疗。然而，传统化疗药物多为DNA合成抑制剂，副作用大，特异性差，极大地限制了其临床应用。近年来，以吉非替尼（ ）为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（-，EGFR-TKIs）在临床治疗中取得了有效的疗效。研究表明，对TKI最敏感的是腺癌，主要发生在亚洲人、女性和非吸烟者中，大多数肿瘤细胞携带EGFR外显子18、19或21突变。然而，随着此类药物在临床应用中的时间推移，发现很多原本对TKI治疗敏感的患者，在接受一段时间的治疗后，会出现获得性耐药。克服 TKI 获得性耐药已成为一个紧迫的临床问题。文献报道患者TKI获得性耐药的主要机制有：外显子突变、EGFR通路下游编码基因如KRAS突变，以及其他EGFR旁路基因如MET异常扩增和癌细胞上皮间质转化(-n , EMT) 等

这些抗性机制主要涉及 DNA 变化。例如，EGFR 突变已被认为是 TKI 获得性耐药的更明确原因。放疗治疗肿瘤的机制是通过破坏肿瘤细胞的DNA来抑制和杀死肿瘤细胞。是否可以通过改变肿瘤细胞的DNA来逆转TKI耐药性，值得探讨。本实验选择人细胞系NCI-（携带外显子突变和外显子20突变）为亲本菌株，对自建的吉非替尼获得性耐药细胞系NCI-/GR进行X射线照射，建立X射线放射性细胞系NCI-/GR/XR。通过比较三种细胞系对吉非替尼的敏感性，探讨体外X射线照射逆转细胞系NCI-吉非替尼获得性耐药的可能性，并初步探索其作用机制，希望吉非替尼能更有效地用于个体化治疗提供一定帮助。方法：1.细胞系建立1.方法明确细胞系NCI-EGFR、KRAS、BRAF基因突变状态；1.2 逐渐增加药物浓度并诱导NCI-体外间歇作用- 细胞产生吉非替尼获得性耐药，用1年时间建立吉非替尼获得性耐药细胞系，命名为NCI-/ GR; 1. 3 X-ray NCI-/GR 细胞照射和照射剂量为6Gy/次。待细胞恢复稳定生长后，消化传代后重复使用相同剂量的X射线照射，共4次，建立X射线照射细胞系，命名为NCI-/GR/XR。希望吉非替尼能更有效地用于个体化治疗提供一些帮助。方法：1.细胞系建立1.方法明确细胞系NCI-EGFR、KRAS、BRAF基因突变状态；1.2 逐渐增加药物浓度并诱导NCI-体外间歇作用- 细胞产生吉非替尼获得性耐药，用1年时间建立吉非替尼获得性耐药细胞系，命名为NCI-/ GR; 1. 3 X-ray NCI-/GR 细胞照射和照射剂量为6Gy/次。待细胞恢复稳定生长后，消化传代后重复使用相同剂量的X射线照射，共4次，建立X射线照射细胞系，命名为NCI-/GR/XR。希望吉非替尼能更有效地用于个体化治疗提供一些帮助。方法：1.细胞系建立1.方法明确细胞系NCI-EGFR、KRAS、BRAF基因突变状态；1.2 逐渐增加药物浓度并诱导NCI-体外间歇作用- 细胞产生吉非替尼获得性耐药，用1年时间建立吉非替尼获得性耐药细胞系，命名为NCI-/ GR; 1. 3 X-ray NCI-/GR 细胞照射和照射剂量为6Gy/次。待细胞恢复稳定生长后，消化传代后重复使用相同剂量的X射线照射，共4次，建立X射线照射细胞系，命名为NCI-/GR/XR。

2. 检测三株细胞的生长情况及其对吉非替尼的耐药性。台盼蓝排除法计数不同浓度吉非替尼处理的三株细胞的活细胞数，描述吉非替尼对其生长抑制曲线的影响；MTT法检测三种细胞系的吉非替尼IC50值和耐药指数；在倒置显微镜下直接观察三种细胞系的形态和生长状态；细胞计数法描绘三种细胞系的生长曲线并计算群体倍增时间：流式细胞术检测三种细胞系加入吉非替尼前后细胞周期分布和凋亡细胞比例的变化. 3. -Blot法检测三种细胞系中E-和蛋白的表达，以了解EMT变化的状态。4. HRMA 方法检测 NCI-/GR/XR 和 NCI-/GR 细胞中 EGFR、KRAS 和 BRAF 基因的突变状态。结果：1. HRMA检测结果表明：NCI-细胞存在外显子突变和外显子20突变。2.三种细胞系的生长情况及其对吉非替尼的耐药性2.1台盼蓝排除法结果显示，吉非替尼24h后，NCI-1975/GR/XR无显着性与NCI-/GR相比活细胞数的差异（P0.05），但从第二天开始，NCI-/GR/XR中的活细胞数显着减少（ P0.05）.在动作的同时，NCI-/GR/XR活细胞数与吉非替尼浓度呈剂量依赖性负相关；2.2MTT法检测三种细胞系的NCI-/GR/XR、NCI-/GR和NCI-的IC50值分别为6.40±0.17μmol/L , 12.42±0.09μmol/L 和 6.15±0.22μmol/L；NCI-/GR对吉非替尼的耐药指数为2.02，X射线照射后的细胞对吉非替尼耐药指数降低至1.04；2. @0.22μmol/L；NCI-/GR对吉非替尼的耐药指数为2.02，X射线照射后的细胞对吉非替尼耐药指数降低至1.04；2. @0.22μmol/L；NCI-/GR对吉非替尼的耐药指数为2.02，X射线照射后的细胞对吉非替尼耐药指数降低至1.04；2.

3. -blot结果显示：与NCI-相比，NCI-/GR细胞的E蛋白表达较弱，蛋白表达增强；与NCI-/GR相比，NCI-/GR/XR细胞的E-蛋白表达增强，蛋白表达减弱。4. HRMA方法的结果表明，与NCI-相比，NCI-/GR/XR和NCI-/GR细胞没有发现新的突变。结论：1. X射线照射可在体外逆转细胞株NCI-吉非替尼的获得性耐药。2. X射线照射逆转吉非替尼获得性耐药的机制可能与“间充质-上皮转化”有关。