细胞肺癌的晚期治疗与一线化疗的对比分析与对比

[摘要]：研究背景与目的：肺癌是当今世界危害最大的恶性肿瘤。其发病率和死亡率均居全球恶性肿瘤之首。全世界每年有超过 150 万例肺癌病例。其中，非小细胞肺癌(non-cell lung)约占肺癌的80%，其中30%-40%在确诊时已经失去了根治性手术的机会[1]。化疗是晚期的主要治疗方法。含铂双药化疗方案是目前晚期一线治疗的标准。然而，无论化疗药物联合使用，接受化疗的晚期患者的中位生存时间约为8至10个月，一年的生存率约为30%-40%，而且它的药效似乎已经达到了一个平台期。近年来，随着肿瘤分子生物学、肿瘤免疫学和细胞生物学学科的快速发展，分子靶向治疗应运而生。分子靶向治疗针对细胞内或细胞上的特定分子，特异性强，不良反应少。是目前肿瘤治疗的研究热点。表皮生长因子受体 (EGFR) 是 ErbB 受体家族的一员，可以促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，提高肿瘤细胞的运动、粘附和侵袭能力，从而增加肿瘤向周围和远处的侵袭和转移。契机，研究表明EGFR的高表达与肺癌的发生发展密切相关[2]。

两项随机、II期临床试验研究表明，对于化疗后复发晚期，吉非替尼可作为二线或三线治疗，不良反应轻微，耐受性好，可长期使用[3]。 ,4]。[5] 研究将吉非替尼作为一线治疗与一线化疗进行比较，结果显示，吉非替尼一线治疗的无进展生存期（PFS）明显优于TP联合化疗，且有最终 OS 数据没有显着差异（18.8 个月 vs.17.4 个月）。随后的III期临床试验和研究表明，对于晚期EGFR基因突变，吉非替尼PFS优于化疗，并有延长总生存期的趋势[6,7]。吉非替尼于2011年被FDA批准用于EGFR基因突变晚期非小细胞肺癌患者的一线治疗。考虑到化疗药物和EGFR-TKIs的作用机制不同，人们希望吉非替尼联合化疗能够提高晚期疗效。目前的体外研究表明，吉非替尼与传统化疗药物（包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西紫杉醇、多柔比星等）联合使用可以增强这些化疗药物抑制癌细胞增殖的能力。效果提示吉非替尼在体外与化疗药物具有协同抗癌作用，这一结果已在动物实验中得到证实[8]。然而，

既往研究表明,EGFR-TKI在化疗中应用无效的机制可能与细胞周期有关[13,14]。化疗后序贯应用EGFR-TKIs的协同作用可能与EGFR磷酸有关。化学相关 [15]。最近的研究表明，IGF-1R 还可以通过细胞内信号蛋白 PI3K/AKT 影响细胞对化疗和 EGFR-TKI 的敏感性 [16,17]。因此，本研究的第二个目的是通过观察多西他赛和吉非替尼对EGFR、IGF-1R的表达和磷酸化、EGFR野生型和突变型肺腺癌中细胞内信号蛋白ERK和AKT的表达和磷酸化的影响。具有不同计时应用的细胞，以及细胞周期变化，寻找可能的细胞学机制。方法1、高分辨率熔解曲线分析（PCR high-，qPCR-HRM）检测A549和PC-9细胞EGFR和Kras基因突变；四甲基偶合MTT比色法检测两种细胞系生长曲线，多西他赛和吉非替尼单药及联合应用对两种细胞系生长的影响；检测细胞信号蛋白的影响；流式细胞术检测细胞周期变化2、采用统计方法进行统计分析。0软件进行统计分析，表示为均值±标准差（Mean±SD），相关组采用One-way检验，不同组间比较采用LSD检验，判断P0.05差异在统计上是显着的。高分辨率熔解曲线分析（PCR high-，qPCR-HRM）检测A549和PC-9细胞EGFR和Kras基因突变；四甲基偶合MTT比色法检测两种细胞系生长曲线，多西他赛和吉非替尼单药及联合应用对两种细胞系生长的影响；检测细胞信号蛋白的影响；流式细胞术检测细胞周期变化2、采用统计方法进行统计分析。0软件进行统计分析，表示为均值±标准差（Mean±SD），相关组采用One-way检验，不同组间比较采用LSD检验，判断P0.05差异在统计上是显着的。高分辨率熔解曲线分析（PCR high-，qPCR-HRM）检测A549和PC-9细胞EGFR和Kras基因突变；四甲基偶合MTT比色法检测两种细胞系生长曲线，多西他赛和吉非替尼单药及联合应用对两种细胞系生长的影响；检测细胞信号蛋白的影响；流式细胞术检测细胞周期变化2、采用统计方法进行统计分析。0软件进行统计分析，表示为均值±标准差（Mean±SD），相关组采用One-way检验，不同组间比较采用LSD检验，判断P0.05差异在统计上是显着的。四甲基偶合MTT比色法检测两种细胞系生长曲线，多西他赛和吉非替尼单药及联合应用对两种细胞系生长的影响；检测细胞信号蛋白的影响；流式细胞术检测细胞周期变化2、采用统计方法进行统计分析。0软件进行统计分析，表示为均值±标准差（Mean±SD），相关组采用One-way检验，不同组间比较采用LSD检验，判断P0.05差异在统计上是显着的。四甲基偶合MTT比色法检测两种细胞系生长曲线，多西他赛和吉非替尼单药及联合应用对两种细胞系生长的影响；检测细胞信号蛋白的影响；流式细胞术检测细胞周期变化2、采用统计方法进行统计分析。0软件进行统计分析，表示为均值±标准差（Mean±SD），相关组采用One-way检验，不同组间比较采用LSD检验，判断P0.05差异在统计上是显着的。流式细胞术检测细胞周期变化2、采用统计方法进行统计分析。0软件进行统计分析，表示为均值±标准差（Mean±SD），相关组采用One-way检验，不同组间比较采用LSD检验，判断P0.05差异在统计上是显着的。流式细胞术检测细胞周期变化2、采用统计方法进行统计分析。0软件进行统计分析，表示为均值±标准差（Mean±SD），相关组采用One-way检验，不同组间比较采用LSD检验，判断P0.05差异在统计上是显着的。

结果1、细胞EGFR和K-ras基因状态A549细胞EGFR基因无突变，K-ras基因外显子2突变；PC-9细胞有EGFR基因外显子19突变，K-ras基因无突变。2、多西他赛和吉非替尼对细胞生长的影响。两个肺腺癌细胞在正常培养中的生长表现出无限繁殖。A549细胞在第二天进入对数生长期，PC-9细胞在第三天进入对数生长期。天数进入对数增长阶段。多西他赛（10-4M-10-10M）和吉非替尼（A549 为 10-2M-10-8M；PC-9 为 10-4M-10-10M）以浓度依赖性方式抑制 A549 和 PC-。9 细胞生长。多西他赛和吉非替尼抑制A549细胞生长72小时的ICso值分别为5.-7mol/L和1.28×10-5mol/L，从而抑制 PC-9 细胞的生长。ICso值分别为2.13×10-8mol/L和4.58×10-8mol/L。吉非替尼对PC-9细胞生长的抑制作用明显强于A549（P0.05)，两种细胞系相差近1000倍。多西他赛序贯吉非替尼对两种细胞菌株的生长抑制具有显着的协同作用，A549和PC-9的抑制效率分别为9.34%（P0.05)和8.94 %（P0.05)，但同时用药仅对PC-9细胞有协同作用（增强7.56%，P0.05)@ > .

3.多西他赛和吉非替尼在不同时间对细胞信号蛋白的影响 PC-9 细胞中 IGF-1R 的磷酸化。多西他赛诱导的EGFR和ERK磷酸化被吉非替尼序贯应用显着抑制。两种药物同时应用对PC-9细胞中IGF-1R的磷酸化抑制作用增强。4.多西紫杉醇和吉非替尼同时序贯应用对细胞周期的影响多西紫杉醇阻断G2期A549和PC-9细胞（分别增加43.28%和30. 13%,P0.05). 吉非替尼对A549无明显G1期阻断作用，但在G1期显着阻断PC-9细胞（增加29.98%， P0.05)。多西紫杉醇序贯吉非替尼对EGFR基因野生型A549和PC-9细胞型和突变型均对细胞生长有协同作用，可能与细胞EGFR和ERK的磷酸化有关。同时，该应用仅对具有基因突变的PC-9细胞有协同作用，这可能与IGF-1R磷酸化抑制有关。吉非替尼后接多西他赛对两种细胞系无协同作用，可能与细胞周期有关。