支气管肺癌的临床治疗方法

[摘要]： 背景与目的：支气管肺癌是全球最常见的呼吸道肿瘤，发病率和死亡率均较高。非细胞肺癌（Non-Cell Lung，）占支气管肺癌的大部分，手术仍是主要的治疗方法。但对于手术患者来说，两年内的复发率在40%左右。因此，全身化疗和靶向治疗仍是术后复发和无手术指征患者的主要治疗方法。但目前常见的一线化疗方案仍不尽如人意，有效率仅为30%左右。因此，寻找新的有价值的治疗方法和策略是非常必要的。靶向治疗联合化疗能否提高化疗疗效已成为国内外重要的研究课题。含铂联合化疗仍是晚期标准的一线化疗方案，第一代铂类药物顺铂是化疗的基石。然而，单一的化疗不能达到预期的治疗效果。随着生物靶向治疗药物的出现，化疗联合靶向治疗能否提高疗效是一个值得研究的课题。吉非替尼是上皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂的第一个代表，该酶通常在上皮来源的实体瘤中表达。作为第一代小分子酪氨酸激酶抑制剂，目前的大规模III期多中心临床试验已经证实，在一线治疗中，吉非替尼对亚洲患者、腺癌、EGFR突变患者的疗效优于化疗。明显的无进展生存期（-Free，PFS）优势，但在能否联合化疗方面，四项大型多中心临床试验已证实表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（-TKI），如吉非替尼厄洛替尼与化疗药物联合使用对晚期非小细胞肺癌患者没有显着的生存获益。

这表明吉非替尼与包括顺铂在内的化疗药物联合使用时可能具有拮抗作用。虽然临床试验结果表明，顺铂与吉非替尼合用具有拮抗作用，但导致这种拮抗作用的机制尚不十分清楚。阐明导致拮抗作用的机制可为临床治疗提供新思路。本项目拟从自噬和外泌体的角度揭示吉非替尼与顺铂联合应用对顺铂治疗效果的影响。研究一 吉非替尼通过上调非小细胞肺癌细胞自噬水平对顺铂作用的影响及其机制研究方法（1)使用吉非替尼联合不同浓度顺铂对人细胞株PC9，采用MTT法测定不同浓度顺铂对PC9细胞增殖的影响,计算吉非替尼与不同浓度顺铂的相互作用指数,分析吉非替尼对不同浓度顺铂的影响。-Blot法分析PC9细胞上吉非替尼联合顺铂和单用顺铂后自噬标志蛋白LC3-II和P62的变化。电镜观察上述两组自噬体数量的变化，进而了解吉非替尼对顺铂诱导的自噬水平的影响。（2) 为了进一步评估自噬的强度，使用了 5μg/ml 溶酶体抑制剂氯喹（，CQ），它抑制了溶酶体降解。

然后加入吉非替尼和/或顺铂，比较没有CQ的组之间LC3表达的变化。因此，可以判断PC9细胞自噬水平的变化是由吉非替尼和/或顺铂诱导的，而不是由自噬降解缺陷引起的。（3)为了观察抑制自噬对吉非替尼与顺铂拮抗作用的影响，我们采用MTT法检测CQ治疗后吉非替尼组和顺铂组PC9细胞，测定OD值并计算CDI了解自噬在吉非替尼引起顺铂耐药过程中的作用。（4)V-FITC/PI流式细胞术检测研究上述治疗后各组细胞凋亡情况，同时, 我们提取了相应组PC9细胞的凋亡蛋白Bcl-2和Bax，以了解自噬水平的变化对PC9细胞凋亡的影响。同时，我们利用流式细胞术技术（Flow，FCM）进行细胞周期分析，了解自噬对PC9细胞周期的影响。结果 1 吉非替尼联合顺铂引起拮抗作用（1) MTT法检测不同浓度吉非替尼和顺铂对PC9细胞的增殖抑制结果表明吉非替尼和顺铂对细胞的抑制作用是时间- 和浓度依赖性。与单独使用顺铂或吉非替尼相比，其他组合组的细胞增殖没有显着降低。（2)药物相互作用系数（药物，CDI) 用于评估药物作用的性质。给予不同浓度的吉非替尼和顺铂后，CDI值为1.19±0.1( 1.07-1.35)，提示有拮抗作用.

透射电镜(TEM)观察吉非替尼和/或顺铂处理后PC9细胞自噬体的变化。结果显示，与单药治疗组相比，吉非替尼联合顺铂治疗组的自噬体数量较单药治疗组增加），且吉非替尼联合顺铂可诱导更高水平的自噬。单一药物。（3)Blot法观察CQ预处理后吉非替尼和/或顺铂处理的PC9细胞中自噬标志物LC3和p62的表达。该结果提示吉非替尼和/或顺铂可诱导PC9细胞为自噬，不是由溶酶体降解引起的。

结果表明，吉非替尼和顺铂均可引起 G1 期阻滞。然而，吉非替尼和顺铂的组合只是略微增加了G1期PC9细胞的比例。为了进一步证实自噬与细胞周期阻滞的关系，我们预处理吉非替尼和/或顺铂CQ（5μg/ml）1小时，结果表明CQ抑制自噬不能逆转吉非替尼和/或顺铂诱导的细胞周期阻滞. (2)Blot检测CQ预处理是否对各组PC9细胞促凋亡蛋白和促凋亡蛋白产生影响。抗凋亡蛋白的表达水平。CQ处理后， Bcl-2（经典抗凋亡家族蛋白）和Bax（促凋亡蛋白）的表达显着降低和升高。

以上结果提示CQ抑制自噬可通过上调Bax和下调Bcl-2的表达促进PC9细胞凋亡。研究吉非替尼通过外泌体上调自噬拮抗给药组顺铂（1μM）/顺铂（7.5μM）外泌体诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡的作用。从用吉非替尼或顺铂处理的PC9细胞上清液中提取外泌体，并分为Exo-Con（来自）、Exo-GF（来自EGFR肺）、Exo-DDP（来自EGFR肺）。使用BCA蛋白检测试剂盒对不同的细胞外蛋白进行标准定量。（2)用透射电子显微镜（TEM）观察外面有外泌体形成，提取成功。（3) 采用CCK-8法检测外泌体预处理后各组细胞抑制率。我们使用一定浓度的外泌体预孵育24小时，然后加入1 μM 。与替尼或 7.5μM 顺铂孵育 24 小时。

采用CCK-8法计算细胞增殖活性，同时计算细胞抑制率。并计算两种药物之间的药物相互作用系数（of Drug，CDI）。然后用外泌体抑制剂作用于各药物治疗组，了解抑制外泌体分泌对吉非替尼或顺铂对PC9细胞作用的影响。（4)每组外泌体和药物一起孵育细胞，通过Blot方法检测自噬标志蛋白LC3和p62的变化，了解外泌体与自噬的相关性。同时，本组采用V-FITC/PI复染试剂和流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡，Blot法检测凋亡蛋白Bcl-2和Bax，并检测外泌体对PC9细胞凋亡的影响。结果 1 吉非替尼联合顺铂治疗产生拮抗作用。采用CCK-8法检测吉非替尼和/或顺铂对PC9细胞增殖的影响。结果显示，与各浓度单药吉非替尼（0.4-2μM）治疗相比，吉非替尼联合顺铂治疗的抗增殖作用仅略有提高。同时计算两种药物在PC9和A549细胞中的CDI值。结果提示，吉非替尼和顺铂联合EGFR突变和野生型PC9细胞系时，存在相互拮抗作用。2 Exo-GF 降低顺铂的抗肿瘤活性。

收集外泌体并向 PC9 细胞中加入一定浓度的顺铂或吉非替尼。CCK-8的结果表明Exo-GF可以以剂量依赖的方式抵消顺铂的抗肿瘤作用。但Exo-Con对顺铂诱导的增殖抑制作用不显着，Exo-DDP对吉非替尼几乎没有作用。采用CCK-8法检测吉非替尼和/或顺铂对外泌体抑制剂预处理后PC9细胞的抑制率。结果显示，加用吉非替尼和顺铂单药后，对PC9细胞的抑制率仅略有增加。但吉非替尼和顺铂联合组预处理后抑制率显着升高，加用后两种药物的CDI值显着降低，表明抑制 Exo-GF 分泌可以逆转吉非替尼和顺铂之间的拮抗作用。3 Exo-GF 上调顺铂诱导的自噬水平。Blot用于检测PC9细胞上Exo-Con、Exo-GF和Exo-DDP的LC3和p62表达。与对照未处理的 PC9 细胞相比，Exo-Con、Exo-GF 和 Exo-DDP 可以显着上调自噬活性。与单药顺铂组相比，Exo-GF预处理顺铂组的自噬显着增强。然而，Exo-DDP预处理对吉非替尼诱导的自噬几乎没有影响。4 Exo-GF 下调顺铂诱导的细胞凋亡。采用流式细胞术（Flow，FCM）检测Exo-GF对顺铂诱导PC9细胞凋亡的影响。

与CCK-8实验结果一致，Exo-DDP对吉非替尼诱导的细胞凋亡无显着影响。进一步采用Blot检测上述处理组PC9细胞中Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。与顺铂组或Exo-Con预处理加顺铂组相比，Exo-GF预处理加顺铂组PC9细胞Bcl-2表达显着上调，Bax下调。与纯顺铂组相比，Exo-GF预处理加顺铂组的Bcl-2/Bax比值显着升高。但与纯吉非替尼组相比，Exo-DDP预处理加吉非替尼组PC9细胞凋亡水平无显着差异。Exo-GF 可以显着下调顺铂诱导的细胞凋亡。结论<