非小细胞肺癌的分子靶向治疗药物-tkis为代表

本发明属于抗肿瘤药物设计技术领域，具体涉及一种用两亲聚合物包封吉非替尼和环孢菌素a制备纳米颗粒的方法及其应用。

背景技术：

分子靶向治疗是在细胞和分子水平上设计相应的治疗药物，靶向明确的致癌位点（该位点可以是肿瘤细胞内的蛋白质分子或基因片段），药物进入体内，特异性选择致癌部位联合作用，使肿瘤细胞特异性死亡，不影响肿瘤周围正常组织细胞。

肺癌是世界上癌症死亡率最高的恶性肿瘤。在中国，肺癌的发病率和死亡率均居首位。大约 80% 的肺癌是非小细胞肺癌。目前非小细胞肺癌的治疗是多学科综合治疗，包括手术、化疗、放疗和分子靶向治疗。与传统的治疗方案相比，分子靶向治疗具有更好的针对性、疗效确切、毒性小等优点，已成为肺癌综合治疗的重要手段。代表非小细胞肺癌的分子靶向药物egfr-tkis。吉非替尼是第一代可逆性 egfr-tkis 分子靶向治疗药物，可显着延长 egfr 敏感突变患者的生存时间，提高生活质量。目前 egfr-tkis 已成为 egfr 敏感突变晚期患者的标准治疗方法。但在这些对治疗敏感的患者中，有的患者从治疗开始就疗效不佳，而有的患者在达到疾病缓解后仍有疾病进展，疾病进展时间约为10个月，提示肿瘤细胞对egfr具有耐药性—— tki 产生了抗药性。免疫抑制剂环孢素a（csa）作为一种多药耐药（mdr）相关蛋白抑制剂，可以逆转多种化疗药物的耐药性。csa 显示通过抑制激活来抑制肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。目前 egfr-tkis 已成为 egfr 敏感突变晚期患者的标准治疗方法。但在这些对治疗敏感的患者中，有的患者从治疗开始就疗效不佳，而有的患者在达到疾病缓解后仍有疾病进展，疾病进展时间约为10个月，提示肿瘤细胞对egfr具有耐药性—— tki 产生了抗药性。免疫抑制剂环孢素a（csa）作为一种多药耐药（mdr）相关蛋白抑制剂，可以逆转多种化疗药物的耐药性。csa 显示通过抑制激活来抑制肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。目前 egfr-tkis 已成为 egfr 敏感突变晚期患者的标准治疗方法。但在这些对治疗敏感的患者中，有的患者从治疗开始就疗效不佳，而有的患者在达到疾病缓解后仍有疾病进展，疾病进展时间约为10个月，提示肿瘤细胞对egfr具有耐药性—— tki 产生了抗药性。免疫抑制剂环孢素a（csa）作为一种多药耐药（mdr）相关蛋白抑制剂，可以逆转多种化疗药物的耐药性。csa 显示通过抑制激活来抑制肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。有的患者从治疗开始疗效不佳，有的患者在达到疾病缓解后仍有疾病进展，疾病进展时间约为10个月，提示肿瘤细胞对egfr-tkis产生耐药性。免疫抑制剂环孢素a（csa）作为一种多药耐药（mdr）相关蛋白抑制剂，可以逆转多种化疗药物的耐药性。csa 显示通过抑制激活来抑制肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。有的患者从治疗开始疗效不佳，有的患者在达到疾病缓解后仍有疾病进展，疾病进展时间约为10个月，提示肿瘤细胞对egfr-tkis产生耐药性。免疫抑制剂环孢素a（csa）作为一种多药耐药（mdr）相关蛋白抑制剂，可以逆转多种化疗药物的耐药性。csa 显示通过抑制激活来抑制肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。作为多药耐药（mdr）相关蛋白抑制剂，可逆转多种化疗药物的耐药性。csa 显示通过抑制激活来抑制肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。作为多药耐药（mdr）相关蛋白抑制剂，可逆转多种化疗药物的耐药性。csa 显示通过抑制激活来抑制肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。

技术实施要素：

本发明提供了由两亲聚合物包封的吉非替尼和环孢菌素-a纳米颗粒。

本发明提供了一种两亲性聚合物包裹的吉非替尼和环孢素纳米粒的制备方法，该方法步骤简单。

本发明提供了一种药物制剂及其应用，包括权利要求1所述的两亲聚合物包封的吉非替尼和环孢素a纳米粒。

本发明将广泛用于肺癌临床治疗的吉非替尼与具有多种抗耐药功能的免疫制剂环孢素a联合使用，可提高肺癌对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。同时，两种药物与两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸共溶解形成纳米颗粒，提高了两种药物的水溶性，实现了两种药物的静脉给药和体内缓释。 . ，减少因大规模口服给药和药物在体内快速释放引起的肝肾毒性。

吉非替尼和环孢菌素是由两亲聚合物包裹的纳米颗粒，两亲聚合物是聚乙二醇-聚乳酸。

吉非替尼的结构式为：

环孢素a的结构式为：

peg-pla的结构式为：

优选地，聚乙二醇-聚乳酸是-。

优选地，所述纳米颗粒中，环孢素a与吉非替尼的摩尔比为100:1～1:40。更优选1:1至1:20

优选地，在纳米粒中，吉非替尼或环孢素a与聚乙二醇-聚乳酸的质量比为1:(5～50)；更优选1:19。该比例不仅可以形成最稳定的纳米粒，还要保证药物的载药量在5%左右。

一种两亲聚合物包封吉非替尼和环孢素-a纳米粒的制备方法，包括：将吉非替尼、环孢素-a和两亲性聚合物溶解在有机溶剂中并混合均匀，将有机溶剂匀速滴入水相后，通过旋转蒸发去除得到均匀分散的纳米颗粒。

本发明提供一种沉淀法制备纳米颗粒的方法，简单，即将前药和-溶解在有机溶剂中混合均匀，匀速滴入水相中，然后除去有机溶剂通过旋转蒸发获得均匀分散的纳米颗粒。

优选地，所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇等中的一种或多种。

一种药物制剂，包括上述任一技术方案所述的两亲聚合物包封的吉非替尼和环孢素a纳米粒。

优选地，药物制剂是片剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂和混悬剂。

上述任一技术方案所述的两亲聚合物包封的吉非替尼和环孢素a纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明使用-将吉非替尼和环孢菌素a非共价包封到纳米颗粒中用于体内递送。在组合物中，pla（聚乳酸）是疏水的，peg是亲水的。- 在水性介质中组装成纳米颗粒，PLA 形成核心，钉形成冠。当静脉内注射时，纳米粒子中的钉冠已被证明可以保护纳米粒子免受吞噬作用（“隐身”），从而最大限度地减少纳米粒子的快速全身清除，从而延长它们的全身半衰期。此外，这种纳米颗粒通过实体瘤的高渗透性和滞留效应（epr）在肿瘤中聚集，从而能够对肿瘤进行高度靶向治疗。而且，将吉非替尼和环孢素a封装成纳米形式，不仅可以提高两者的水溶性，

本发明提供了单独包封吉非替尼、单独包封环孢菌素a以及两者包封在一起的纳米粒子的粒度分布图和扫描电镜照片，平均粒径均在20-50nm范围内。纳米粒子粒径小，易于通过肿瘤部位的EPR效应，在肿瘤部位蓄积，减少对正常组织的损伤，更好地发挥抗肿瘤作用。

本发明通过体外细胞毒性试验验证，两药联用对肿瘤细胞的毒性作用明显优于单药，两药联用可显着降低一半抑菌浓度（ic50)值，表现出良好的协同作用。1um环孢素a纳米粒（csa-nps）在天然吉非替尼耐药肺癌细胞和获得性耐药肺癌细胞pc-9-gr中可以降低吉非替尼纳米粒子 (gef-nps) 的 ic50 值从 18.51μm 和 29.29μm 到 9.32μm 和 19.30um。

本发明还提供了共同负载的纳米颗粒在体外促进细胞凋亡的证据。与单独使用 csa-nps 相比，Gef-nps 联合 csa-nps 在耐药和非耐药 细胞中更明显促进细胞凋亡。说明了两种药物联合使用的协同作用。

本发明进一步提供了对共载纳米颗粒治疗效果的体内评价。结果表明：与生理盐水对照组相比，两药联合纳米粒静脉给药组肿瘤缩小2.6倍；与单独吉非替尼纳米颗粒相比，肿瘤缩小2.5倍，与口服二药联合组相比，前药纳米颗粒组肿瘤缩小1.7倍。说明两药联合用药效果优于单药，包装纳米粒静脉给药的药效优于口服给药组。体内试验结果为该药的优越性提供了有力证据，

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明使用的环孢素a对于克服小分子药物吉非替尼的耐药性有相应的科学依据和解释，具有一定的合理性。

(2)本发明采用包衣材料聚乙二醇-聚乳酸，提高了吉非替尼和环孢素a的溶解度，即使小剂量静脉给药也能有效抑制肿瘤。

(3)本发明的纳米粒子粒径均在20-50nm范围内，粒径小，在肿瘤部位容易通过epr效应，可保留在肿瘤部位发挥其药效。

（4)本发明使用的聚乙二醇-聚乳酸是一种无毒、生物相容性和可生物降解的高分子材料。而且，上述高分子材料已获得美国FDA批准上市使用，它具有临床转化效果好。

（5)体内实验结果表明，两种药物联用对体重影响不大，也就是说毒性小，副作用小，更容易通过临床试验并获准上市。

图纸说明

图 1 显示了使用 peg-pla 将吉非替尼和环孢菌素 a 封装成纳米颗粒。

图 2 显示了纳米粒子的粒径和潜力。

图3显示了纳米药物对非小细胞肺癌细胞的毒性作用。

图4显示了纳米共载体系统对非小细胞肺癌的促凋亡作用。

图a、b、c分别代表pc-9、pc-9-gr，接受纳米颗粒给药后细胞凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）的统计结果，图d、e、f是这三种细胞的流-通过凋亡图，分别对应a、b、c，右上象限和右下象限分别代表晚期细胞凋亡和早期细胞凋亡的比例。

图 5 显示共同加载的纳米系统抑制了 pc-9-gr 异种移植物的生长。

图a为裸鼠不同给药方式后肿瘤大小的变化。图b显示了观察期间裸鼠体重的变化。图c排列了不同组裸鼠的肿瘤组织。d组是c组中不同裸鼠组中肿瘤的平均重量。

图中，csa-nps 表示纳米颗粒简单地被环孢素包裹；gef-nps 表明吉非替尼纳米颗粒是简单封装的 gef-nps；csa/gef-nps 表明环孢素和吉非替尼都被包裹在一起纳米颗粒；gav 表示灌胃给药；iv是指静脉内给药。* 表示 p<0.05，** 表示 p<0.01，*** 表示 p<0.001。

详细说明

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不限于此。

实施例 1 用途 - 将吉非替尼和环孢菌素 A 封装到纳米颗粒中

继续搅拌后用旋转蒸发仪蒸发溶液中的丙酮。丙酮易沸腾，在旋蒸过程中应在茄形大瓶中进行。当溶液中产生气泡并逐渐膨胀时，应及时将茄形瓶提离液面并放气，以降低真空度。加热温度始终不超过40°C。旋转蒸汽直到不再有气泡并且溶液中丙酮的刺鼻气味不再定量是否最终体积为10ml，如果小于10ml，则加入重蒸水使总体积为10ml，即得到0.1mg/ml的共载纳米粒子水溶液。采用同样的丙酮法制备单独包封吉非替尼或环孢素a的纳米颗粒，吉非替尼或环孢素a与包封材料的质量比为1:20。吉非替尼或环孢素纳米颗粒溶液的浓度也是0.1mg/ml。

实施例2 纳米颗粒的粒度和潜力。

通过透射电子显微镜（TEM）观察颗粒的形态。样品制备：取上述0.1mg/ml纳米颗粒1.5ml至浓缩管中，转速离心5-10分钟。当浓缩至约300μl时，浓度约为0.@>5mg/ml。将一滴0.5mg/ml 的纳米颗粒溶液点在铜网格上，用2% 乙酸双氧铀负染，在空气中干燥，在透射电子显微镜下观察。纳米粒子的粒度分布和Zeta电位测试通过动态光散射仪测量纳米粒子的粒度分布(pdi)和Zeta电位。激光以 90° 入射，入射波长为 。所有样本都通过 0. 22μm 微滤膜，然后添加到塑料比色皿或电位样品池中进行测量。每个样品平行测试 3 次，测试温度为 25 ℃，平衡时间为 2 min。得到的粒径和电位是样品的平均值。环孢素-a纳米粒（csa-nps）、吉非替尼纳米粒（gef-nps）、环孢素和吉非替尼共载纳米粒（csa/gef-nps）的粒径检测结果和透射电镜观察结果见如图。2. 由图2可以看出，本发明的环孢素和吉非替尼共载纳米粒的粒径在20-50nm范围内，粒径较小，容易通过epr效应。肿瘤部位，并且可以保留在肿瘤部位。.

实施例3 纳米药物对非小细胞肺癌细胞的毒性。

为考察实施例1对肿瘤细胞生长的抑制作用，采用的方法为mtt，具体方法如下：

贴壁的非小细胞肺癌细胞pc-9和pc-9-gr用胰蛋白酶消化，细胞用dmem培养基吸管均匀，计数并稀释成适当浓度的细胞悬液。将肿瘤细胞接种于96孔板中，每孔5000个细胞，100 μl，4个重复孔，培养24小时。在显微镜下观察贴壁细胞后，用移液器小心吸出原液，并添加一系列预先配置的 csa-nps、gef-nps 和 csa/gef-nps 浓度梯度。空白组纳米粒为对照组。空白组培养基不加任何药物。继续培养48小时。每孔加入30ul浓度为5mg/ml的mtt溶液，孵育4小时，加入二甲亚砜（dmso），用酶标仪检测每个孔的吸光度，并测量波长。计算药物ic50。计算相对细胞活力的公式为=(/)×100%。其中 a 表示 处的吸收值。细胞相对活力为实验组与空白组的吸光度之比，每组数据取4个重复孔的平均值。统计学方法：细胞毒性评价采用t检验，p<0.05认为有显着统计学差异。如图 3 所示，可以观察到吉非替尼纳米粒子和环孢素纳米粒子的明显协同作用。单独使用环孢素a纳米颗粒对细胞的毒性不是很大，但同时使用时，低浓度的 csa-nps 可显着降低 gef-nps 的 ic50 值，同时增强吉非替尼对耐药和非耐药细胞的耐药性。药物细胞的杀伤能力。

实施例4 纳米共载体系统对非小细胞肺癌的促凋亡作用。

将三种非小细胞肺癌细胞（pc-9、pc-9-gr）以2.0×105/孔的密度接种于六孔板中，贴壁过夜后加入不同的细胞。 csa-nps、gef-nps或csa/gef-nps浓度，用流式细胞仪检测48小时内细胞凋亡，使用试剂盒，按试剂盒说明书操作。将原细胞培养液全部转移到15ml离心管中（含所有悬浮细胞），用PBS清洗贴壁细胞一次，用0.25%胰蛋白酶不加EDTA消化细胞，达到合适的消化状态后，加入上一步收集的细胞培养液终止消化。轻轻吸移细胞后，将它们一起转移到离心管中，800 rpm 离心 5 分钟，去除上清液。收集的细胞用PBS重悬，再次离心5分钟，弃上清，用1×μl重悬细胞，计数，调整细胞数为1×106个/ml。取 100μl 细胞悬液加入 5ml 样品管中，将剩余细胞系中凋亡较多的细胞悬液分装到 3 个校准样品管（空白、fitc 单阳性、pi 单阳性）中，分别加入 5μl 和 5μl pi 至每个样品的样品管；根据需要加入校准样品管（无空白管，fitc单阳性5μl，pi单阳性5μl pi），轻弹样品管底部混合均匀，室温避光孵育15分钟。最后，向每个样品管中加入 1×μl，然后进行流式细胞枪测量。-fitc 是绿色荧光，pi 是红色荧光。如图4所示，gef-nps联合csa-nps显着提高了耐药和非耐药肺癌细胞的凋亡率。

实施例5 共同负载的纳米系统抑制pc-9-gr异种移植物的生长。

本发明采用pc-9-gr人非小细胞肺癌异种移植裸鼠模型，评价实施例1中的前药纳米粒的抗肿瘤作用。当达到裸鼠皮下肿瘤体积时，开始分组给药，每组6只裸鼠。实施例2中的3种纳米粒子尾静脉注射给药，剂量为20mg/kg。对照组pbs组注射等量，每2天一次，共注射3次。吉非替尼的非纳米颗粒形式以及吉非替尼和环孢菌素a的组合都是口服给药。该药物以 20 mg/kg 的剂量连续给药 6 天。施政后，继续观察测量肿瘤的长宽和裸鼠体重，根据肿瘤体积和体重的变化判断药物的抑瘤效果和药物毒性。裸鼠。各种药物的抑瘤作用见图5。从图中可以看出，与生理盐水对照组（ ）相比，单独使用吉非替尼和吉非替尼纳米粒对耐药肺异种移植物的抑制作用癌细胞不明显，单独使用吉非替尼颗粒对肿瘤没有抑制作用。两种药物联合口服给药组对肿瘤有一定的抑制作用。与口服联合给药组相比，包封这两种药物的纳米静脉给药组具有更明显的抑瘤作用。再次验证了本发明的优越性。且两药合用对体重影响不大，说明毒副作用小。