肺癌患者的吉非替尼耐药的产生可能是多种机制共同作用

概括：

背景与目的：肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在世界各国均呈上升趋势。由于其早期发现、诊断和治疗困难，严重威胁人类健康。目前肺癌的主要治疗方法仍是手术、化疗和放疗，总体疗效并不理想。尤其是一些晚期肺癌患者，往往因失去手术机会而需要大剂量化疗以延长生存期，而化疗药物显着的毒副作用也让患者深受其害。作为一种新型分子靶向治疗药物，吉非替尼可抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶的活性。它延长了患者的生存时间，提高了患者的生活质量，但几乎所有服用该药的患者最终都会产生耐药性，从而限制了其长期疗效。目前的研究表明，吉非替尼耐药的产生可能是多种机制共同作用的结果，研究表明吉非替尼的调控可能参与了吉非替尼在肿瘤获得性耐药的过程中。它是一类非编码内源性小RNA分子，通常由20-22个核苷酸组成，广泛存在于各种生物体中，在转录后水平负调控基因表达。研究相继发现，参与人体的各种生命活动，可以促进细胞增殖，调节细胞凋亡通路，参与细胞周期的调节，参与人体的新陈代谢过程。肿瘤的发生与异常的细胞增殖、分化和凋亡密切相关。通过这些癌症相关通路已经发现了一些肿瘤相关通路，如miR-126、miR-14等。在耐药基因调控的相关研究中，发现miR-27a和miR-451与P-糖蛋白表达和MDR1基因产物的激活有关，可能导致肿瘤细胞产生耐药性。它还涉及对吉非替尼的获得性耐药的发展。一些研究发现mir-128b可以靶向EGFR，在很多非小细胞肺癌肿瘤样本中都可以检测到mir-128b杂合性的缺失，而mir-128b杂合性缺失与吉非替尼的临床疗效有关。疗效与生存率之间存在显着相关性。肺癌细胞中let-7a、miR-12的过表达6、可以控制AKT和ERK的活性，增加肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。转染mir-126后，肺癌细胞的耐药指数可提高6倍。目前，国内外关于吉非替尼在肿瘤获得性耐药机制中作用的研究很少。因此，需要进一步研究吉非替尼在肺癌获得性耐药机制中的作用。选择个体化方案以避免和克服对吉非替尼的获得性耐药具有重要意义。

肺癌对吉非替尼的耐药性是临床常见问题，一直困扰着肺癌的治疗。本研究旨在通过对吉非替尼敏感和耐药人肺腺癌细胞株耐药差异的分析和鉴定，建立吉非替尼敏感和耐药人肺腺癌细胞株。人肺腺癌细胞的表达谱与人肺腺癌细胞对吉非替尼的耐药性密切相关。.

方法：本研究通过MNNG诱变从PC9细胞中筛选出高敏感性PC9细胞和三种不同吉非替尼IC50的耐药细胞系PC9/AB2、PC9/AB11、@。>PC9/BB4为研究对象。倒置显微镜观察4种细胞株的形态学差异，细胞仪绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间。流式细胞仪用于检测四种细胞系的循环分布。替尼对4株细胞的IC50、敏感PC9细胞与3株耐药细胞的生物学特性和耐药性差异鉴定、3株耐药株之间的生物学特性和耐药性等方法，在此基础上，进一步应用表达谱芯片技术筛选鉴定人肺腺癌细胞中与吉非替尼耐药相关的差异表达谱。构建吉非替尼获得性耐药相关的表达载体和对照载体，转染耐药细胞系，筛选获得性耐药机制相关的表达载体和对照载体。

结果：

1.耐药细胞系PC9/AB2、PC9/AB11、@>PC9/BB4与敏感细胞系PC9相比，PC9/BB4细胞形态变化更明显，且胞体细长；与敏感的PC9细胞相比，PC9/AB11在G0/G1期的分布明显高于PC9（P=0.009)，PC9/AB2、PC9/ BB4在G0/G1期分布显着低于PC9细胞（P均0)；PC9/AB11细胞在G2/M期分布与PC9细胞无显着差异， G2/M期PC9/BB4细胞分布明显低于PC9细胞（P=0.031)，G2/M期PC9/AB11细胞分布明显低于PC9 细胞 (P=0);

2.MTT法检测细胞的IC50，敏感PC9细胞的IC50为(0.022±0.01)μmol/L，耐药的IC50 PC9 细胞为 (0.022±0.01)μmol/L) AB11 为 (2.07±0.11)μmol/L , PC9/BB4细胞的IC50为(0.973±0.176)@ >μmol/L, PC9/AB2细胞的IC50为(12.383±1.351、0@>μmol/L，3株耐药细胞株与敏感株差异显着（P1、1@>与对照PC9细胞相比，耐药细胞株的表达谱显示： PC9/AB2细胞中19个上调，11个下调；PC9/AB11细胞9个系中4个上调，11个下调；PC9/BB4细胞中18个系上调，7个系下调。

1、2@>构建miR-503.1(+)/-mir-503的表达质粒，转染PC9/AB11细胞和PC9/AB2细胞。与转染1(+)/对照组相比，转染0.1(+)/-mir-503后，耐药细胞的IC50显着降低，具有统计学意义。

1、3@>构建miR-100.1(+)/-mir-100的表达质粒，转染PC9/AB11细胞和PC9/AB2细胞。与转染1(+)/对照组相比，转染0.1(+)/-mir-100后，耐药细胞的IC50无明显变化，无统计学意义。

1、4@>构建miR-138.1(+)/-mir-138的表达质粒，转染PC9/AB2细胞。与转染1(+)/对照组相比，转染1(+)/-mir-138对耐药细胞的IC50无明显变化，无统计学意义。转染PC9/AB11细胞，与转染1(+)/对照组相比，转染1(+)/- mir-138后耐药细胞的IC50有显着变化，具有统计学意义。

1、5@>将miR-21-miR-21抑制剂转染到PC9/BB4细胞中。与转染miR-21相比，两者IC50差异无统计学意义。

结论：吉非替尼敏感性人肺癌细胞株及其衍生的吉非替尼耐药细胞株具有不同的吉非替尼IC50，获得性耐药细胞的吉非替尼IC50显着升高。获得性耐药细胞系和吉非替尼敏感细胞系的表达谱显着不同。获得性耐药细胞系中miR-503和miR-138的低表达可能与吉非替尼的获得性耐药有关。