EGFR以亚克隆形式存在，EGFRTKIs激酶耐药机制

时间：2022.02.17作者： 浏览次数：421

研究背景

EGFR 主要以亚克隆形式存在，是对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 获得性耐药的最常见机制。然而，由于EGFR从头突变很少见，因此对第三代EGFR TKI获得性耐药的机制知之甚少。

材料和方法

在 4 名 EGFR 从头突变的患者中，使用第三代 EGFR TKI 治疗前后的肿瘤和血浆样本分析获得性耐药机制。通过全外显子组测序（WES）、靶向测序、荧光原位杂交（FISH）和基因突变分析。 Ba/F3系统证实了MTOR的致癌性，并在/Cas9-RNP的细胞系中复制了该突变。

每个变体的癌细胞分数 (CCF) 计算如下：

从头 EGFR 突变被定义为包含 EGFR 和激活 EGFR 突变（或外显子 19 缺失或）的大多数等位基因。

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研究结果

从 2002 年 12 月到 2014 年 7 月，在首尔国立大学医院，690 名 EGFR 突变患者中的 7 名 (1%) 通过回顾性审查被确定为新发 EGFR 突变。这7例肺腺癌临床特征见1例，均无肺癌家族史。其中4人（LC1-4)接受第三代EGFR TKI后部分缓解）获得耐药（中位27个月，范围：17-48个月）。

MTOR 突变被确定为对奥希替尼产生获得性耐药的机制：LC1 患者每天接受 80mg 奥希替尼作为第八线治疗 17 个月（图 1A 和 1)。治疗前获得的肿瘤组织（LC1a）在奥希替尼获得耐药性（LC1b）之后。使用 LC1a 和 LC1b 基因组数据计算和绘制突变 CCF（图 1B）。TP53 突变的 CCF 源自 LC1a 0.497 增加到 1.034 LC1b（图 1B）。将 LC1a 中未检测到的 MTOR 突变克隆到 LC1b 肿瘤中（CCF，0.983；图 1B 和 C）。用于验证 WES 中发现的突变等位基因频率。

MTOR 突变具有致癌性，并通过激活 EGFR/突变细胞中的 AKT 赋予对奥希替尼的耐药性：尽管 MTOR 突变在乳腺癌和肾癌中已有报道，但其在肿瘤中的作用尚未研究。 MTOR 突变和致病性 MTOR 突变如、和被转导到 Ba/F3 细胞系中以确认它们的致癌潜力。 MTOR 突变 Ba/F3 细胞在没有 mIL-3 的情况下生长，与其他 MTOR 突变 Ba/F3 细胞相似，表明其具有致癌性（图 2B）。

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使用 /Cas9 RNP 在含有克隆 EGFR/突变的 NCI 细胞系中复制 MTOR 突变（图 3A）。 MTOR 突变细胞比亲代 NCI 细胞对奥希替尼更具抗性（图 3B）。尽管奥希替尼抑制了 MTOR 突变细胞中的 EGFR 信号传导，但 AKT 的磷酸化仅被部分抑制（图 3C）。

奥希替尼联合MTOR抑制剂逆转MTOR和EGFR/突变细胞对奥希替尼的耐药性：奥希替尼联合mTOR抑制剂表现出协同作用（图3D）。奥希替尼联合 mTOR 抑制剂对 mTOR 突变细胞的抑制作用与单独使用奥希替尼对亲代细胞的抑制作用相似（图 3D）。此外，在 MTOR 突变细胞中，奥希替尼联合 mTOR 抑制剂可抑制 AKT 磷酸化和 mTOR 下游信号传导，而单独使用奥希替尼不抑制（图 3E）。

MET 扩增与 LC2 患者的奥希替尼耐药相关：LC2 患者每天一次接受一线奥希替尼治疗 28 个月（图 4A 和 1)。拷贝数分析显示 14 个 MET 基因拷贝具有高 fpkm（MET 和 EGFR 分别为 721.9 和 75.26）。此外，通过使用 FISH 检测验证了 MET 扩增（图 4B 和图 7).

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WES 和 RNA 测序检测到 6 个 MGA 基因拷贝和保守的 T-box 结构域5.67 fpkm 克隆和从头 MGA 突变（图 4C 和 D）。肿瘤组织分析表明，LC2b 中 MGA 突变的比例高于 LC2a（17% vs 71.1%）。尽管如此，MGA 突变不会致癌。

/ 和突变是患者LC3和LC4对第三代EGFR TKIs的获得性耐药突变：患者LC3接受一线75 mg每天一次，持续57个月（1，图5A）。耐药时采集血浆样本 (LC3a) 和恶性心包积液 (LC3b)。在具有 EGFR 突变的顺式 LC3b 中检测到 EGFR/突变（图 5B）。 EGFR ///突变 Ba/F3 细胞在没有 mIL-3 的情况下生长，类似于 EGFR/突变细胞，但比 EGFR //突变 Ba/F3 细胞具有更低的生长潜力（图 5C）。 EGFR /// 突变 Ba/F3 细胞对第三代 EGFR TKI（奥希替尼和）耐药（图 5D 和 4).

患者 LC4 接受二线奥希替尼 80 mg，每日一次，持续 32 个月（1 和图 5E）。在奥希替尼治疗之前获得恶性胸腔积液（LC4a），分别在奥希替尼治疗期间和之后收集LC4b和LC4c血浆样本。在 LC4c 血浆中仅检测到 EGFR (c.>c) 突变，频率较低（丰度 1.43%）。在 LC4a 肿瘤和 LC4b 血浆样本中未检测到这种突变（图 5F）。

讨论

本研究评估了 EGFR TKIs 的疗效，并确定了对第三代 EGFR TKIs 奥希替尼在新发 EGFR 突变患者中的耐药和耐药机制。

旁路激活和 EGFR 或 EGFR/突变被确定为新发 EGFR 突变患者对第三代 EGFR TKI 获得性耐药的机制。此外，MTOR和EGFR/突变细胞对奥希替尼+mTOR抑制剂敏感。