【中信期货】晨报精粹：单抗（）耐药细胞凋亡

#1438#PLA , 2008, 33, 12 Med J Chi n PLA V ol 33 No 12 D 2008 贝伐珠单抗对耐药鼻咽癌细胞凋亡的影响孙婷婷徐江平刘慧=文摘> 目的观察贝伐珠单抗()对体外耐药鼻咽癌细胞凋亡的影响。方法以人鼻咽癌低分化细胞系CNE2及其顺铂（DDP）耐药细胞亚系CNE2/DDP为研究对象。细胞体外分别用不同浓度的贝伐单抗和DDP处理，MTT法检测两者。两种药物对CNE2/DDP的杀伤作用，流式细胞术测定CNE2和CNE2/DDP的凋亡率，半定量RT PCR检测CNE2、 用贝伐单抗处理的 CNE2/DDP 和 CNE2/DDP 细胞 bc-2、 基因表达的变化。结果 10Lg/ml贝伐珠单抗对CNE2/DDP细胞的杀伤率(52%?43%)与空白对照组l bax 1 1 (0 0%?4 1%, P = 0 180)、10Lg/ml 贝伐单抗和 0 1、 2Lg/ml DDP 比单独使用 DDP 具有更高的杀灭率（42 3%？6 5% vs 1 1 1 1 0 1 1 1 34 4%？5 4%， P = 0 041; 62 6%? 5 5% vs 50 0%? 5 9%, P = 0 009)。62 6%？5 5% vs 50 0%？5 9%，P = 0 009)。62 6%？5 5% vs 50 0%？5 9%，P = 0 009)。

Liu Hui of, y, Sout hern Un1 i,, = To the on of drug (NPC)> in vitr o. (N PC) 细胞系 CNE2 和它的 CNE2/DDP 是有和 DDP 的。然后药物 s 和在 CN E2/DDP 上的有 M TT 和流动，Bc-2 和 Bax 的 mRNA 在CN E2、CNE2/ DDP 和 l CNE2/ DDP/ Bev 使用 sem-RT PCR。10Lg/ml 组中的比率为 (0 0? 4 1% vs. 5 2? 4 3%, P = 0 180), 10Lg/ml 和 DDP 1 1 1 1 1 (0 1Lg/ml 和 0 2Lg/ml,) 高于仅 DDP (42 3?6 5% vs. 34 4? 5 4%, P = 0 041; 62 6? 5 5% 1 1 1 1 1 1 1 1 1 vs. 50 0? 5 9%, P = 0 009)。 CNE2/DDP 的比率，由 0 1Lg/ml DDP 和 10Lg/ml 1 1 1 i 计算，比 DDP 高得多（87 29?3 38% vs. 50 58?8 83%，P = 0 04< @9).通过sem-quan 1 1 1 1 1 i RT PCR，CNE2中Bcl 2 mRNA的，CNE2/ DDP 和 CNE2/ DDP/ Bev 分别为 0 613、0 952 和 0 135，re 1 1 1.，Bax mRNA 的分别为 0 665、0 387 和 1 751。1 1 1 sion将CN E2/DDP的药物转化为DDP；在 MDR 中，但可以通过。= 键>;; 药品，; 抗血管内皮细胞生长因子VEGF单克隆抗体是晚期结直肠癌的一线治疗药物[1]，目前对其抗肿瘤机制的研究几乎集中在抑制肿瘤血管生成。但临床观察到，它可以使部分化疗失败的肿瘤患者恢复对化疗药物的敏感性。这不能通过抗血管生成来完全解释。这很可能是通过促进耐药肿瘤细胞的凋亡来实现的。但它可以通过。= 键>;; 药品，; 抗血管内皮细胞生长因子VEGF单克隆抗体是晚期结直肠癌的一线治疗药物[1]，目前对其抗肿瘤机制的研究几乎集中在抑制肿瘤血管生成。但临床观察到，它可以使部分化疗失败的肿瘤患者恢复对化疗药物的敏感性。这不能通过抗血管生成来完全解释。这很可能是通过促进耐药肿瘤细胞的凋亡来实现的。但它可以通过。= 键>;; 药品，; 抗血管内皮细胞生长因子VEGF单克隆抗体是晚期结直肠癌的一线治疗药物[1]，目前对其抗肿瘤机制的研究几乎集中在抑制肿瘤血管生成。但临床观察到，它可以使部分化疗失败的肿瘤患者恢复对化疗药物的敏感性。这不能通过抗血管生成来完全解释。这很可能是通过促进耐药肿瘤细胞的凋亡来实现的。经临床观察，可恢复部分化疗失败的肿瘤患者对化疗药物的敏感性。这不能通过抗血管生成来完全解释。这很可能是通过促进耐药肿瘤细胞的凋亡来实现的。经临床观察，可恢复部分化疗失败的肿瘤患者对化疗药物的敏感性。这不能通过抗血管生成来完全解释。这很可能是通过促进耐药肿瘤细胞的凋亡来实现的。

本研究以阳性表达VEGF及其受体的人鼻咽部低分化鳞状细胞系CNE2和对顺铂（DDP）耐药的细胞亚系CNE2/DDP为研究对象，不同浓度DDP 在体外与贝类结合使用。处理细胞观察其杀伤作用、促凋亡作用及其对bc-2、基因表达的影响。l bax 1 材料与方法 1 1 细胞系、1 药物和试剂，由人鼻咽癌低分化细胞系学院附属医院肿瘤分子生物学实验室提供，在含10%小牛的高糖DMEM培养基中培养血清，培养条件为 37e，CO2，5% 饱和湿度培养箱，用含有 0 125% 胰蛋白酶和 0 102% EDTA 的复合消化液消化和传代。DDP购自江苏豪森制药厂，贝伐单抗购自美国公司。高糖DMEM培养基购自美国公司，小牛血清购自兰州民海生物公司，胰蛋白酶购自上海化学试剂公司，二甲基四唑（MTT），二甲亚砜（DMSO）购自美国公司,FIT C凋亡试剂盒购自南京凯基公司，RT PCR反应体系购自广州大汇公司。

1 12 贝伐单抗处理的细胞在CNE2/DDP细胞培养基中=作者简介>研究=作者单位>=通讯作者>广州南方医科大学药学院药理学系（孙婷婷，徐江平，：jpx@ smu edu cn 1 1 徐江平); 解放军总医院肿瘤科（刘辉）孙婷婷，硕士生。主要从事分子靶向抗肿瘤药物CNE2及其顺铂耐药细胞系CNE2/DDP的研究。33，第12期，2008年12月，Med J Chin PLA V ol 33 No 12 2008#1439#加入贝伐单抗浓度为10Lg/ml，每4天传代一次，连续传代4次获得细胞CNE2/DDP/Bev . 1 3 MT T法检测DDP联合贝伐珠单抗的细胞杀伤效果1 CNE2/DDP细胞接种于96孔板中，按表1设计的对照组和实验组加入DDP和贝伐珠单抗，他们应该培养72小时。每孔加入5mg/ml MTT 15L继续孵育4h，除去上清液，每l加入DMSO，每孔加入DMSO，室温振摇溶解晶体，用酶标仪。

杀灭率=（实验组每孔1-A值/对照组平均A值）@100%。1 4 流式细胞术检测 DDP 联合贝伐单抗对 1 CNE2/DDP 细胞凋亡的影响 0 1L ml，孵育 24 小时，消化，1 g/离心，转移至管中，用 PBS 洗涤两次，加入细胞缓冲液至悬浮，加入5Ll An?/FIT C和碘化丙啶溶液（PI）双染，混合匀浆后，室温避光孵育，弃上清，PBS溶液洗一次，避光，流式检测细胞凋亡细胞术。实验重复 3 次。15 bc-2、 mRNA 表达的半定量RT-PCR 检测 1 l bax 引物采用0 软件设计，由广州大汇1 生物公司合成。引物序列为：bc-2 有义 5-GT c T CCT T GAGT CT G 3-c，反义 3-TC 5c，产品大小；bax 5-TC c GCT-3 3-T c, c TAGT -5 产物大小；B 阳性 c，有义 5-CT GT-3 反义 3c c，c CT CGT CCT GCT T GCT-5 产物大小。

C。取对数生长期CNE2、 CNE2/DDP、CNE2/DDP/Bev 7个细胞各1@10个，按照试剂盒说明书消化和提取RNA。逆转录条件：37e恒温1小时，95e灭活3分钟。PCR反应条件：94e预变性5min，94e 45s，e 45s，e 56 72 80s，共35个循环，最后72e延伸8分钟，4e保存。反应结束后，取5L PCR反应液和1L上样缓冲液充分混匀，用微量移液管加入凝胶梳孔底部。使用琼脂糖凝胶电泳仪进行电泳。出线电压为120V，出线后电压调至60V。用凝胶成像系统观察、拍照，用Labw ork软件分析测定光密度值，计算bc-2、 l bax（与内参B的比值）的相对表达量。16 统计处理数据结果以xs表示，采用SPSS 1 100软件进行统计分析。细胞杀伤效果采用单因素方差分析进行多样本均值比较和样本均值间多重比较（LSD法），细胞凋亡率比较采用秩和检验，P<0.05认为差异有统计学意义.

1 2 结果仍为0.2Lg/ml DDP，1 g/ml 贝伐珠单抗联合10L ml 的杀灭效果显着高于单独使用DDP，差异有统计学意义（P <0 105，表1)表1 不同浓度DDP联合贝伐珠单抗对CNE2/DDP细胞(x?S,n=6)?表1L的DDP对CNE2/DDP(?s, n = 6) x? 分组控制组 实验组 0 0 1 1 0 1 1 0 2 1 0 2 1 10 0 10 0 10 5 2? 4 3( 1) 1 1 34 4? 5 4 1 1 42 3? 6 5( 2) 1 1 50 0? 5 9 1 62 6? 5 5( 3) 1 1 DDP (Lg/ ml) 0 (Lg/ ml) 0 杀灭率(%) 0 0? 4 1 1 1 注：与对照组相比，（1) P = 0 180；与单独使用 0 1Lg/ml DDP 组相比，（2) 1 1 P= 0 041;与单独使用0 2Lg/ml DDP组相比，(3) P= 0 009 1 1 12 12 DDP联合贝伐珠单抗诱导CNE2/DDP细胞凋亡。流式细胞术显示0 1L ml DDP+ 10L ml 1 g/g/贝伐珠单抗组(87 3%?3 1 14%)显着高于DDP单药组(50 6%?8 1 18%)，差异有统计学意义(P<0 10< @5)。

2 13 CNE2、 CNE2/ DDP, CNE2/ DDP/ Bev 细胞 bc- 2、 l bax mRNA表达半定量RT PCR检测显示CNE2、 CNE2/ DDP和CNE2/ DDP / bc-2在Bev细胞中的相对表达水平分别为0 1613、 952和0 0 1 1135，bax的相对表达水平为0 1665、 0 1387和1 751，分别 (图1)。1ͼ, E2/ DDP, CN CNE2/ DDP/ Bev 细胞 bc- 2、 l baxa CNE2; b CNE2/ DDP; c CN E2/ DDP/ Bev 1 1 表达水平 1 -CNE2、CNE2/ DDP 和 CN E2/ DDP/ Bev 的 bcl 2 和 bax mRN A 讨论 2 1 MT T 法检测 DDP 联合贝伐珠单抗的细胞杀伤效果 对照组相似，两者差异无统​​计学意义（P> 0 10<@5).

无论是0 1Lg/ml 1 贝伐单抗，贝伐单抗的抗肿瘤血管生成作用已被大量体外[2 3]和临床实验证实。贝伐珠单抗联合化疗对结直肠癌有显着疗效，使人抵抗血管生成。药物和化疗药物在肿瘤治疗中的协同作用引起了人们的兴趣。本研究结果表明，贝伐单抗确实可以通过促进耐药肿瘤细胞的凋亡来增加其对化疗药物的敏感性。bc-2基因具有抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的作用，而bax基因通过其编码产物与bc-2表达的蛋白质形成异源二聚体，使后者失活，发挥l#1440#[4]Med J Chi n PLA V ol 33 No 12 D 2008, Vol. 33号12，2008年12月，中国人民解放军医学杂志。其促凋亡作用。本研究中，对于亲本CNE2细胞，当用DDP诱导耐药，再用贝伐珠单抗处理时，bc-2基因的表达先上调后显着下调，bax的表达基因先下调后显着上调，这种变化与细胞杀伤作用和细胞凋亡率的变化一致，表明贝伐单抗可以上调细胞凋亡的机制。最新观点认为，抗肿瘤药物是细胞凋亡的诱导剂，化疗药物的细胞毒作用可能主要是触发肿瘤细胞程序性死亡的途径。细胞凋亡可能是大多数化疗药物的最终共同作用途径[5]。

因此，耐药的本质是细胞通过一定的保护反应下调或关闭细胞凋亡机制来逃避细胞毒药物的杀伤，而贝伐单抗很可能通过打开细胞凋亡途径使细胞毒药物再次发挥作用。VEGF 是一种高度糖基化的碱性蛋白，由巨噬细胞、血管平滑肌细胞和肿瘤细胞产生。它作为血管内皮细胞特异性的有丝分裂原，并与血管内皮细胞上的特异性受体 FLT 1 相互作用。KDR/flk 1 的组合刺激血管内皮细胞的增殖 [6] 并促进血管生成。同时，它还有一个重要的功能，那就是抑制肿瘤细胞的衰老和凋亡。当肿瘤细胞受到化疗药物的攻击时，大量肿瘤细胞死亡，少数肿瘤细胞通过自分泌作用分泌大量VEGF。与其他细胞因子一样，通过上调凋亡抑制基因的表达和下调促凋亡基因的表达来抑制自身凋亡，从而在化疗药物的作用下存活下来，临床表现为耐药。对于处于化疗药物压力下的肿瘤细胞，高浓度的VEGF是维持其存活的重要因素。贝伐珠单抗作为VEGF的特异性抗体，可有效阻断VEGF的生物学活性，使肿瘤细胞失去保护，启动凋亡程序，易被化疗药物杀死。当然，贝伐单抗不直接靶向细胞。在没有化疗药物的情况下，由于缺乏有效的细胞凋亡诱导剂，它不具有细胞杀伤作用。这也是本研究单独使用贝伐单抗时的细胞杀伤率。与空白对照组相比，无显着差异。

=参考文献>[1] [2] 罗荣成 1 肿瘤生物治疗 1 北京：人民医学出版社，2005 78 1 BG, JC, CG, et al,, 1 and w it ht in: ?t rial s Int J Biol Phys , 2007, 68( 2): 472 1 [3] C, M, FJ et al Ant-pept ides 1 i and: From al tool to Bio 1 phys A ct a, 2006, 1765( < @2): 155 [4] [5] [6] 高杰, 郭玉, 钟梅, 等. 1 恶性间皮瘤细胞凋亡与凋亡调控蛋白Bax 和Bc-2 表达的关系1 医学杂志中国人民解放军, 2008, 33( 3): 311 l 林文, 李德瑞1 鼻咽癌多药耐药的研究现状 1 中国癌症, 2006, 15( 2): 102 王晓静, 徐江平,程玉芳 1 灵芝孢子粉对裸鼠移植人肝肿瘤血管生成的抑制作用 1 徐州医学院学报, 2006, 26 (2): 115 (2008 -07 2008-10 ) - 09 -11（责任主编李恩江）#书Ѷ#临床局部麻醉技术 本书是目前国内第一本规模最大、最全面、最先进的临床局部麻醉专着。

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