新型抗人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体生产方法研究

抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种含有抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂及其应用。

背景技术

[0002] 血管内皮生长因子(VEGF)是一种高度特异性的生长因子，具有促进内皮细胞有丝分裂、促进血管生成、增加血管内皮通透性、保护神经等功能。VEGF广泛分布于人脑、肾、肝、眼等组织器官。其中，视网膜周细胞、色素上皮细胞、内皮细胞、神经节细胞等均可表达VEGF。

[0003] VEGF的过表达可引起新生血管异常增殖，导致多种疾病，如肿瘤、眼部新生血管增生性疾病等。其中，眼部新生血管增生性疾病包括年龄相关性黄斑变性（age-，AMD）。)、糖尿病视网膜病变(, DR)、新生血管性青光眼(, NVG)等。目前已有多种针对VEGF的药物开发和应用。其中，开发较成功的是VEGF单克隆抗体，如首个抗血管生成剂贝伐珠单抗。

[0004] CN B公布了一种新型抗人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体原液的制备，但未公开药物制剂成分。此外，与常规化学药物相比，抗体药物的质量在长期储存过程中更容易受到多种因素的影响。抗体药物可能会发生各种物理或化学变化，如变性、降解、聚合或氧化等，从而影响药物的活性。影响药物的疗效并带来毒副作用。针对这一问题，本发明制备并获得了稳定的药物制剂。

发明内容

[0005] 本发明涉及一种含有抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂及其应用。

[0006] 本发明的抗体包含序列SEQ ID No:1和SEQ ID No:2、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4、SEQ ID No:1和SEQ ID No:4，或SEQ ID No:4 ID No：2和SEQ ID No：3。

[0007] 本发明的抗体生产方法参见专利CN B。

[0008] 为了保持抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的稳定性和活性，本发明的药物制剂包括药物缓冲液，该缓冲液包括但不限于柠檬酸钠/柠檬酸、醋酸盐、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、Tris盐酸和组氨酸/组氨酸盐酸中的一种或多种。

[0009] 为了保护抗人血管内皮生长因子单克隆抗体药物的结构，本发明的药物制剂含有保护剂，其包括但不限于蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、蔗糖和山梨糖醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖和木糖醇中的一种或多种。

[0010]为了增加药物制剂的稳定性和抑制聚集体的形成，药物制剂中含有聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、丙二醇、二甲亚砜或其他药学上可接受的一种或多种可接受的表面活性剂。

[0011]本发明提供的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体药物制剂，主要成分包括：a)2-/ml的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体；b) 5-/ml pH 缓冲液；c) 2.5-/ml 保护剂；d) 0·03-1·2mg/ml表面活性剂；将 pH 值调整为 5.0-7.0。

[0012]药物制剂活性成分的优化组合：a)3-/ml抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，其结构包括SEQ ID No:1和SEQ ID No:2，或SEQ ID No: 3 和 SEQ ID No: 4 序列；b) 10-1/ml pH缓冲液，选自柠檬酸钠/柠檬酸、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、Tris盐酸、组氨酸/组氨酸盐酸中的一种或多种；c) 5-70mg/ml的保护剂，选自甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖和海藻糖中的一种或多种；d) 0.05-1. Omg/ml 表面活性剂，选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、丙二醇、二甲亚砜或其他药物可接受的一种或多种表面活性剂；将 pH 值调整为 <

[0013] 药物制剂的活性成分优化包括：a) 4-/ml的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，含有SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；b) 15-/ml pH缓冲液，磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、组氨酸/组氨酸盐酸中的一种或两种；c) 8-60mg/ml保护剂，选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、精制酸中的一种或多种；d) 0.08-0.8mg/ml 表面活性剂，选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、一种或多种丙二醇；将 pH 值调整为 5 · 5-6 · 5。

[0014] 更优化的药物制剂组合为:a)5-/ml的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，含有SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；b) 20-/ml 磷酸氢二钠/磷酸二氢钠；c) 10-50mg/ml 甘露醇；d) 0.1-0.5 mg/ml 聚山梨醇酯 80；将 pH 值调整为 6 · 0-6 · 3 。

[0015] 在一些实施方案中，抗人血管内皮生长因子单克隆抗体为8-25mg/ml。

[0016] 在一些其他实施方案中，抗人血管内皮生长因子单克隆抗体为25-60mg/ml。

[0017] 在另一个实施方案中，抗人血管内皮生长因子单克隆抗体是60-/ml。本发明的药物制剂可以通过以下制备方法得到： 1) 按照抗人血管内皮生长因子单克隆抗体、pH缓冲剂、保护剂和表面活性剂的比例混合；2)调节pH值到5.0-7.0；3) 过滤除菌、除菌。

[0018] 所述药物制剂制备方法还可以包括以下冻干步骤，具体为：预先将冻干机的板温冷冻至1J-HTC以下，对制备的药液进行灭菌过滤，装入合适的小瓶中。中号。半压后，放在预冷的平板上，_30°C以下预冻4小时，开始抽真空。真空度低于80Pa后，板坯应0.1~0.，升温速度为5℃/min。温度达到-25~-20℃后，保持24~48小时。当可见水印消失时，温度逐渐升高。最后一层温度保持在15~30°C 3~5小时。插好后，从盒子里拿出来，盖上牛奶。

[0019] 本发明的药物制剂可以多种方式储存。在一些实施方案中，药物制剂储存在小瓶中，而在其他实施方案中，药物制剂储存在预装注射器中。中间。本发明的药物制剂也可以储存在安瓿中。上述储存方法可以储存在0.〇5-5ml。

[0020]本发明的药物制剂可用于治疗多种疾病。例如，它可以用于治疗肿瘤，可以抑制肿瘤部位血管的生长。由于肿瘤生长与血管生成密切相关，本发明的药物制剂可用于治疗胃癌、肝癌、白血病、肺癌、小肠癌、骨癌、直肠癌、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌和许多其他癌症。本发明的药物制剂还可用于治疗多种非肿瘤性疾病，包括：类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、糖尿病等增殖性视网膜疾病等，尤其是眼底新生血管疾病，

[0021] 本发明的药物制剂可以单独给药，或以各种组合给药，并与其他治疗剂组合给药。

[0022] 本发明的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体制剂可以通过多种方式给药于患者，包括但不限于静脉给药、眼内注射、皮下给药、眼玻璃体注射或滴眼液给药通过眼睛和其他方法。

图纸说明

[0023] 图 图 1 不同保护剂条件下药物制剂的差示荧光扫描 (DSF) 结果。

[0024] 图 2 不同聚山梨酯体系条件下37℃下90天的药物制剂SEC-HPLC检测结果图。具体实施例

[0025]实施例1不同pH和缓冲系统对5mg/ml(低浓度)抗血管内皮生长因子单克隆抗体药物制剂稳定性的影响。将抗血管内皮生长因子单抗原溶液脱盐至纯净水中。加入配制好的缓冲母液，终浓度为50 mmol/L（pH 3.6、4.0、5.0 and 5.6使用柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液，pH 6.0 和7.0 使用磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液，pH 8.0 使用 Tris 盐酸缓冲液），并调整最终抗血管内皮生长因子单克隆抗体浓度为5mg/ml，无菌过滤。每组样品分为 2 ml 小瓶，密封，置于37℃恒温培养箱中。在第 30 天取样，通过还原 SDS-PAGE 和 SEC-HPLC 测试纯度。

[0026] 表1药物制剂在37°C下不同pH和缓冲系统下30天研究的SEC-HPLC纯度

测试表明，在 37 °C 下放置 30 天时，SEC-HPLC 显示 pH 8.0 显着降低。还原SDS-PAGE结果显示pH 3.6、4.0和8.0均显示出明显的非特异性条带。

[0027]实施例2不同pH和缓冲系统对/ml(高浓度)抗血管内皮生长因子单克隆抗体药物制剂稳定性的筛选。

[0028] 为了研究pH和缓冲体系对制剂稳定性的影响，分别制备了不同pH缓冲母液(包括pH5.0、5.5和< @6.0. / , pH 6.0、6.5 and 7.0 选择磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液）。将抗血管内皮生长因子单抗原溶液超滤浓缩后用纯水置换，加入各缓冲液的母液至终浓度为30 mmol/L。同时，将抗血管内皮生长因子单克隆抗体调整至终浓度为200 mg/ml，无菌过滤。

[0029] 表2 37°C不同时间不同pH和缓冲体系下药物制剂的SEC-HPLC纯度

实验表明，在高浓度下，抗血管内皮生长因子药物制剂在pH5.0和pH7.0的条件下显着增加了聚集和降解。pH 5.5 到 6.5 之间的聚集和降解没有显着差异。并且在pH 6.0时，组氨酸/组氨酸盐酸盐缓冲系统与磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲系统对蛋白质稳定性没有显着差异。

[0030] 实施例3 选择保护剂长期保存会导致抗血管内皮生长因子药物制剂的聚集体增加，这主要是由于蛋白质构象的缓慢变化导致暴露某些疏水区域，从而导致蛋白质分子暴露。聚集在一起形成聚合体。海藻糖、甘露醇、蔗糖、精氨酸等保护剂可与蛋白质分子相互作用，提高蛋白质稳定性，抑制聚集体形成。

[0031] 3.1保护剂对蛋白质热稳定性的影响本实施例中蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖、海藻糖、单组分如如蔗糖和精氨酸对蛋白质热稳定性的影响；空白对照组为不加保护剂的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液组。将抗血管内皮生长因子单抗原溶液替换成/L磷酸盐缓冲液（pH6.1)，至终浓度为2 mg/ml。加入蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸和甘氨酸）各单组分浓度见表3。 根据差示荧光扫描（DSF）试剂盒（Life ，货号）的要求，

[0032] 表3不同保护剂条件下药物制剂的熔融温度(Tm)

从Tm值可以看出，与空白对照组相比，不同浓度海藻糖、甘露醇、蔗糖和精氨酸的药物制剂的蛋白质Tm值显着升高，表明蛋白质的热稳定性好。获得。其他保护剂加成组效果不明显。

[0033] 3.2 药物制剂的加速稳定性试验根据实施例3.1的结果，进行了加速稳定性试验。将抗血管内皮生长因子单抗原溶液置换成/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液（pH6.1)至终浓度25mg/ml。加入海藻糖和甘露醇、蔗糖和精氨酸单组分，浓度见表4。 所得药物制剂经无菌过滤后37℃保存，第30、60、90天取样，SEC-HPLC分析纯度.

[0034] 表4 37°C不同时间不同保护剂条件下药物制剂的SEC-HPLC纯度

试验结果表明：各种浓度的甘露醇均能有效抑制聚集体的形成，增加制剂的稳定性。其余保护剂海藻糖、蔗糖、精氨酸组在放置90天后单体纯度均明显下降，聚集体的增加未受到明显抑制。

[0035]实施例4表面活性剂的选择表面活性剂可以抑制蛋白质分子间的相互作用，增加蛋白质的溶解性和稳定性。在本实施例中，实验研究了聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20对抗血管内皮生长因子单克隆抗体聚合物的抑制作用。

[0036] 将抗血管内皮生长因子单抗原溶液超滤至/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液（pH6.1)，至终浓度25mg/ml，加入甘露醇至40mg/ml，同时加入5%聚山梨醇酯80和5%聚山梨醇酯20母液使终浓度0.03mg/ml，0.25mg/ml和1.2mg/ml。药物制剂在37℃下保存，分别在第30、60和90天取样进行SEC-HPLC分析，部分结果见表5和图2。

[0037] 表5 37°C不同时间不同聚山梨酯体系条件下药物制剂的SEC-HPLC纯度

试验表明，三种不同浓度的聚山梨醇酯80在90天内对药物制剂中的聚集体形成有较好的抑制作用，而聚山梨醇酯20抑制聚集体形成的作用较聚山梨醇酯80弱。

[0038] 实施例5 制剂稳定性考察 称取适量甘露醇、聚山梨醇酯80、磷酸二氢钠和磷酸二氢钠，用注射用水搅拌溶解，然后加入适量的高浓度抗血管内皮生长因子单抗原溶液，各配方成分见表6。

[0039] 表6不同配方配方组分

在 2-8°C 下研究药物制剂的长期稳定性。采用还原SDS-PAGE电泳、SEC-HPLC、IEC-HPLC检测蛋白纯度，采用人脐静脉内皮细胞增殖抑制法研究其生物学活性。部分结果如表 7 所示。

[0040] 表7不同药物制剂的长期稳定性研究

实验表明，方剂3中各项纯度指标均有一定下降，生物活性也有明显下降。但方剂1和方剂2放置3个月和6个月后，其纯度指标和生物活性没有明显下降。

[0041] 实施例6药物制剂抑制小鼠高氧诱导视网膜血管生成的药效学研究将45只新生KM小鼠随机分为3组，其中药物组：将小鼠和母鼠一起置于密闭高氧箱中，从隔日出生实施例5中处方1的药物制剂25mg/kg腹腔注射；模型组：小鼠和雌性大鼠一起关在密闭的高氧箱内，饲养在常氧箱内。出生后隔日腹腔注射生理盐水；正常组：小鼠和母鼠一起饲养在正常的氧气环境中。出生后第 21 天，每组 6 只小鼠被麻醉并进行 FITC-心室灌注、视网膜铺展、荧光显微镜观察新生血管形成和荧光渗漏；每组6只小鼠12只眼甲醛固定石蜡包埋切片切片后HE染色观察视网膜极限膜细胞数。结果显示，正常组小鼠视网膜结构正常，几乎没有荧光泄漏；模型组血管迂曲扩张，新生血管和荧光渗漏；抗血管内皮生长因子药物组小鼠的血管状况优于模型组，荧光渗漏较少。视网膜内界膜血管内皮细胞数量统计汇总见表8。

[0042] 表8小鼠视网膜内界膜血管内皮细胞数