抗VEGF单克隆抗体靶向药物贝伐珠单抗的疗效及作用机制

时间：2022.04.19作者： 浏览次数：813

目的：通过移植肿瘤动物实验探讨奥希替尼联合抗VEGF单克隆抗体靶向药物贝伐单抗的疗效及作用机制，为进一步的临床试验提供理论依据。

方法：构建EGFR突变人肺腺癌异种移植动物模型。

实验分组：小剂量奥希替尼组、大剂量奥希替尼组、小剂量奥希替尼联合贝伐单抗组、大剂量奥希替尼联合贝伐单抗组。每组5只小鼠，给药方法：奥希替尼2.5 mg/kg/d或5 mg/kg/d，每日灌胃；贝伐单抗 5 mg/kg，每周 2 次腹腔注射。接种后及给药过程中绘制肿瘤生长曲线，给药后2周处死裸鼠，对整个肿瘤进行活检。免疫组化SP法检测肿瘤HIF-1α、VEGF和微血管密度（ , MVD）。采用印迹法检测EGFR及其下游AKT和ERK信号通路蛋白的表达。

结果：给药2周后，大剂量奥希替尼单药组和小剂量奥希替尼单药组肿瘤体积明显缩小，HIF-1α、VEGF、MVD表达率明显降低（P0. 05）。大剂量奥希替尼联合组与大剂量奥希替尼单药组的体积差异无统计学意义（P=0.642）. 两个联合组两组体积差异无统计学意义（P=0.072），上述因子表达无显着差异（P> 0.05）)。

结论：贝伐单抗可显着提高奥希替尼对EGFR突变肺腺癌异种移植物的杀伤能力。贝伐单抗和奥希替尼的协同作用是通过降低肿瘤中VEGF的表达、改善肿瘤微环境、增强和抑制EGFR下游信号通路的激活来实现的。

关键词：非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抗血管生成治疗肿瘤微环境

肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，其中85%为非小细胞肺癌（non-cell lung）[1]。化疗联合抗血管生成靶向药物可显着延长非鳞状细胞癌患者的总生存期（OS）[2-5]。近年来，个体化分子靶向治疗取得了巨大成功。对于EGFR敏感突变（外显子19缺失[E19 del]和外显子21点突变[E21]），与传统化疗相比，第一代或第二代EGFR-TKI治疗可显着改善患者预后。预后。

AURA-3 III 期临床研究显示，奥希替尼的客观缓解率（ORR）高达 71%，中位无进展生存期（free，mPFS）高达 71%。 EGFR-TKI，过去曾获得突变。) 10.1 个月[6]。

血管内皮生长因子（VEGF，VEGF）在血管生成中起重要作用，是肿瘤内皮细胞存活所必需的。贝伐单抗降低 VEGF 水平以阻断新血管形成，使肿瘤中的曲折血管暂时正常化，改善肿瘤氧合并降低间质液压力，并恢复药物输送到肿瘤中，这可能使肿瘤细胞对 . II 期临床试验表明，与单药厄洛替尼相比，厄洛替尼联合贝伐单抗可显着延长 EGFR 敏感突变患者的 mPFS（16 个月 vs. 9.7 个月），与纯 EGFR 敏感的患者相比突变，

本研究通过构建突变裸鼠肺癌异种移植模型，并在奥希替尼联合或不联合贝伐单抗的情况下进行干预，探讨肿瘤微环境变化对第三代EGFR-TKI治疗突变肺癌的影响及相关的分子机制。，为进一步的临床试验提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

人肺腺癌细胞系（EGFR E20）是四川大学华西医院赠送的。实验动物为20只SPF雌性裸鼠BALB/C裸鼠（4-6周龄，约20g），购自北京华福康生物科技有限公司，实验动物许可证号SCXK（北京）2014-0004。经医院动物护理和应用委员会批准。

奥希替尼购自美国公司；贝伐单抗购自瑞士罗氏；ECL Plus发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。免疫组化SP超敏试剂盒、DAB试剂盒购自北京中山金桥生物科技有限公司。CD34、@ > 和HIF-1α抗体购自武汉博斯特生物工程有限公司。EGFR、AKT、ERK和p-EGFR、p-AKT、p-ERK购自美国克鲁兹公司，抗体购自来自美国公司。

1.2 种方法

1.2.1细胞培养及裸鼠异种移植模型的建立

印度9291奥希替尼图片_奥希替尼9291药品_奥希替尼是血管抑制剂吗

细胞在 RPMI 1640 培养基（含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）中于 37°C、5% CO2、90% 湿度的培养箱中培养，细胞贴壁。取对数生长期细胞，消化计数，以2×106个/mL细胞/细胞皮下接种于小鼠右后肢前侧腹壁。大约 1 周后肿瘤开始形成，并且在接种后和给药期间每周至少测量两次肿瘤体积。

当小鼠肿瘤平均生长至0.2～0.4 cm3时，随机分为4组：A组（Low-O）：低剂量奥希替尼组（n=5 , 0.4 cm3)2.5mg/kg/d); B组（高氧）：高剂量奥希替尼组（n=5, 5 mg/kg/d）；C组（Low-OB）：奥希替尼低剂量联合贝伐单抗给药组（n=5，奥替替尼2.5 mg/kg/d，贝伐单抗5 mg/kg，每周两次）；D组（High-OB）：大剂量奥希替尼联合贝伐单抗给药组（n=5，奥希替尼5 mg/kg/d，贝伐单抗5 mg/kg，2周二等）。平均肿瘤体积达到0.4～0.6 cm3（肿瘤体积V=L×W2×π/6）时开始药物干预。给药方法：每日给予奥希替尼灌胃治疗，每周两次腹腔注射贝伐单抗。

1.2.2 免疫组化检测判断标准

活检组织用4%多聚甲醛溶液固定48 h，常规脱水，石蜡包埋，切片。最后，DAB 被开发，用苏木精复染，并安装。采用常规光镜观察表达，每个切片至少随机选取5个400倍视野，采用染色阳性细胞和染色强度双重评价法[8-9]。如果没有发现阳性细胞，记0分；如果阳性细胞比例小于等于10%，记1分；如果阳性细胞比例为 11% 至 50%，则为 2 分；如果阳性细胞比例为 51% 至 80%，则为 3 分；细胞率>80%者记3分；没有颜色或颜色模糊的记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。最终结果通过添加两项来确定：3为弱阳性，4-5为中度阳性，6-7为强阳性，此时阳性细胞比例为

1.2.3 印迹检测

将各组异种移植标本在冰水浴中匀浆，然后裂解（加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）以提取蛋白质。BCA法测定蛋白浓度，混合5×上样缓冲液，煮沸3 min，冰浴快速冷却。蛋白封闭2 h，加入相应一抗4℃孵育过夜（作为内参）。洗涤后与二抗孵育，显化学发光，用J分析各靶蛋白的灰度值，进行检测分析。

1.3 统计分析

使用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据表示为 x ± s。各组肿瘤体积、各样本灰度值、MVD、VEGF、HIF-1α表达比较采用t检验。与 P

2 个结果

2.1 异种移植裸鼠的肿瘤生长

实验过程中，A、C、D组各有1只裸鼠死亡，其余裸鼠状况良好。切除后各组移植瘤（图3）。各治疗组移植瘤裸鼠给药前及处死后肿瘤体积变化（表1））。肿瘤细胞接种< @2.5 周后。（给药前）各治疗组肿瘤体积无显着差异（P>0.05）。给药 2 周后，奥希替尼联合贝伐单抗两组的肿瘤体积均显着小于低剂量奥希替尼单药组（P

2.2异种移植裸鼠肿瘤组织中VEGF和HIF蛋白的表达及MVD免疫组化结果显示，VEGF在肿瘤细胞的细胞质或细胞膜中表达，而HIF-1α在细胞核中表达（图4，5），奥希替尼联合贝伐单抗组VEGF、HIF-1α表达率低于单药组（P

联合贝伐单抗组的 MVD 低于单药组（P

2.3 各组EGFR及其下游AKT和ERK通路蛋白的表达

用印迹法检测各治疗组的蛋白结果（图中阳性细胞百分比为51%～80%记3分，阳性细胞百分比>80%记3分；无显色或发色模糊者记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。最终结果以两次相加来判断：3为弱阳性，4-5为中度阳性，6-7为强阳性，当阳性细胞比例

1.2.3印迹法检测各组移植瘤标本。

在冰水浴中均质化后，通过裂解（添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）提取蛋白质。BCA法测定蛋白浓度，混合5×上样缓冲液，煮沸3 min，冰浴快速冷却。蛋白封闭2 h，加入相应一抗4℃孵育过夜（作为内参）。洗涤后与二抗孵育，显化学发光，用J分析各靶蛋白的灰度值，进行检测分析。

1.3 统计分析

使用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据表示为 x ± s。各组肿瘤体积、各样本灰度值、MVD、VEGF、HIF-1α表达比较采用t检验。与 P

2 个结果

2.1 异种移植裸鼠的肿瘤生长

实验过程中，A、C、D组各有1只裸鼠死亡，其余裸鼠状况良好。各组切除后移植瘤（图3）.

各治疗组移植瘤裸鼠给药前和处死后肿瘤体积变化（表1）。肿瘤细胞接种后5周治疗组间肿瘤体积无差异2.（给药前). 统计学意义(P>0.05）。给药2周后，两组奥希替尼联合贝伐单抗的肿瘤体积均显着小于小剂量奥希替尼单独用药。组（P

▶A. 低剂量 ; B. 大剂量；C. 低剂量加；D.大剂量加图1 各治疗组给药2周后移植瘤6）。与低剂量奥希替尼组相比，高剂量奥希替尼单药组p-EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达显着降低（P0.05） .

3 讨论

有研究提出，获得性EGFR-TKI耐药后，肿瘤VEGF水平会升高，提示耐药后肿瘤细胞对EGFR信号通路的依赖性会降低，而对VEGF信号通路的依赖性会增加[10] . 本研究表明，EGFR信号通路仍然是耐药突变肺癌细胞重要的生长依赖性信号通路。奥希替尼对 EGFR 及其下游 PI3K/AKT/mTOR 和 Ras-Raf-MAPK 信号通路具有抑制作用。瓦利木单抗改善了肿瘤组织中的微环境，增强了对这两种信号通路的抑制，从而更有效地杀死肿瘤细胞。

EGFR 和 VEGF 相关的信号通路在肿瘤发生和发展中都起着至关重要的作用。EGFR 的异常激活导致肿瘤增殖加速和不受调节，而 VEGF 信号传导与肿瘤血管生成有关。等[11]提出肿瘤血管生成依赖于“血管生成开关”的激活，这是VEGF最常见的亚型。与NRPs（）结合后，触发并激活下游信号通路，促进血管内皮增殖和迁移。VEGF还可引起微血管通透性增加，还可聚集循环内皮细胞前体、相关免疫细胞和间充质细胞，在构建肿瘤微环境中起重要作用。[12] 表明 EGFR 通路和 VEGF 通路具有“

本研究观察到，随着奥希替尼剂量的增加，药物的抗肿瘤作用增强，与VEGF抗体联合使用时，奥希替尼的抗肿瘤作用也增强。从肿瘤生长曲线可以看出，贝伐单抗的协同抑瘤作用比单药剂量加倍更显着。建议适当剂量的奥希替尼联合抗血管治疗可能比单纯增加奥希替尼的剂量带来更大的益处。另一方面，这种联合用药可以降低单次增加药物剂量引起的剂量限制性毒性，当然贝伐单抗联合用药也会增加高血压和出血的风险。在实验中，两个组合组各有一只小鼠死亡。需要注意的是，与低剂量奥希替尼组小鼠在实验后期因肿瘤负荷大而死亡不同，联合组小鼠死亡发生在贝伐单抗给药后第3天。 . 是药物本身引起的还是实验操作引起的。

本实验还观察到奥希替尼联合贝伐单抗组VEGF的表达和微血管密度均低于奥希替尼单药组，但奥希替尼联合贝伐单抗组并未引起微血管密度。HIF-1α的表达降低和升高。研究表明，HIF-1α可以增强肿瘤细胞的上皮间质转化，重塑细胞外基质，诱导耐药，并能增强肿瘤干细胞的活性，辅助肿瘤细胞免疫逃逸的产生。本研究表明，贝伐单抗虽然抑制肿瘤血管生成，但改善了肿瘤内环境，从而改善了肿瘤组织的供氧。这也符合 Jain 等人提出的抗血管生成治疗中血管的正常化。[13]：1周内，抗血管生成治疗可使曲折变形的血管变得更加正常，增加组织氧含量。然而，治疗持续了 2.5 周，远远超出了血管正常化的时间窗。等 [14] 认为 HIF-1α mRNA 和蛋白质的合成不仅依赖于氧气，而且很大程度上依赖于 PI3K 和 MAPK 通路。但在高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐单抗治疗组中，PI3K和MAPK信号通路受到抑制，因此可以解释HIF-1α表达降低的原因。抗血管生成疗法可以使曲折和变形的血管变得更加正常，并增加组织氧含量。然而，治疗持续了 2.5 周，远远超出了血管正常化的时间窗。等 [14] 认为 HIF-1α mRNA 和蛋白质的合成不仅依赖于氧气，而且很大程度上依赖于 PI3K 和 MAPK 通路。但在高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐单抗治疗组中，PI3K和MAPK信号通路受到抑制，因此可以解释HIF-1α表达降低的原因。抗血管生成疗法可以使曲折和变形的血管变得更加正常，并增加组织氧含量。然而，治疗持续了 2.5 周，远远超出了血管正常化的时间窗。等 [14] 认为 HIF-1α mRNA 和蛋白质的合成不仅依赖于氧气，而且很大程度上依赖于 PI3K 和 MAPK 通路。但在高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐单抗治疗组中，PI3K和MAPK信号通路受到抑制，因此可以解释HIF-1α表达降低的原因。等 [14] 认为 HIF-1α mRNA 和蛋白质的合成不仅依赖于氧气，而且很大程度上依赖于 PI3K 和 MAPK 通路。但在高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐单抗治疗组中，PI3K和MAPK信号通路受到抑制，因此可以解释HIF-1α表达降低的原因。等 [14] 认为 HIF-1α mRNA 和蛋白质的合成不仅依赖于氧气，而且很大程度上依赖于 PI3K 和 MAPK 通路。但在高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐单抗治疗组中，PI3K和MAPK信号通路受到抑制，因此可以解释HIF-1α表达降低的原因。

观察到奥希替尼可以降低下游激活的p-EGFR的表达并影响PI3K/AKT/mTOR和Ras-Raf-MAPK双重信号通路。这与[15]之前关于奥希替尼单药在体外和体内实验中的作用机制的发现是一致的。贝伐单抗联合用药增强了这两种信号通路的抑制作用，这也从分子机制上解释了联合用药能够带来更多肿瘤缩小的原因。

综上所述，本研究通过移植肿瘤的动物实验证实，第三代EGFR-TKI奥希替尼对EGFR突变的肺腺癌异种移植物具有较强的抑瘤作用，而贝伐单抗可显着提高奥希替尼对肺腺癌异种移植物的杀伤能力。随着EGFR突变，两者具有协同作用。贝伐单抗和奥希替尼的协同作用是通过降低肿瘤中VEGF的表达、改善肿瘤微环境、增强和抑制EGFR下游信号通路的激活来实现的。该研究为进一步的临床试验提供了理论依据。

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