EGFR驱动突变的晚期非小细胞肺癌的惊人疗效

摘要： 目的：以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）为代表的分子靶向药物已应用于临床，在治疗EGFR驱动突变的晚期非小细胞肺癌中取得了惊人的疗效。然而，患者最终会在中位 9-13 个月后产生获得性耐药性。EGFR基因第20外显子突变是主要的耐药机制，被认为代表它的第三代EGFR-TKI已进入临床应用，可进一步延长患者的生存期。然而，没有更好的方法来克服其他耐药机制，迫切需要新的研究方法。有证据表明它与肿瘤的耐药性有关。本项目旨在筛选耐药性，探索人肺腺癌细胞系与耐药相关基因相互调控的机制。方法：通过逐步药物浓度和间歇作用在体外诱导PC9细胞获得耐药细胞株PC9/GR。还包括人肺腺癌 A549 和细胞系。采用MTT法计算4个细胞对的半抑制率（IC50)，直接测序获得4个细胞系EGFR基因外显子19-21的突变谱；PC9和PC9的差异表达谱）基因芯片检测PC9/GR，筛选最终研究；结合应用等生物信息学软件和网络数据库，预测靶基因；构建过表达和低表达细胞系，MTT 检测和流式细胞仪检测细胞抵抗和存活的变化；RT-PCR 和 Blot 验证靶基因和蛋白质表达的变化；沉默PC9靶基因后，采用MTT和流式细胞仪进一步检测PC9细胞敏感性的变化。

结果：获得了药物诱导的耐药细胞株PC9/GR，IC50高达26.599μmol/L，PC91.187μmol/L，A549 16.648μmol/ L , 9.002 μmol/L; 微阵列检测PC9和PC9/GR的差异表达谱，PC9/GR中78个上调2倍，129个下调1/2；miR-221-3p 在 PC9/GR 中表达。GR 上调 2.45 倍，RT-PCR 证实 miR-221-3p 的表达水平在两种细胞系之间存在显着差异，p=0.0002。直接测序显示 PC9 细胞外显子 del E746-749、PC9/GR 外显子 749、A549 EGFR 19-21 均为野生型，EGFR 外显子 20 合并 21 。miR-221在PC9细胞中表达上调，miR-221在PC9/GR、A549和PC9细胞中表达下调。MTT增加PC9细胞的耐药性，IC50增加4倍。PC9/GR和耐药性被逆转，IC50分别降低。2.6-fold 和 2.97-fold, 均具有统计学显着性差异，而 A549 无显着变化。

流式细胞仪显示，作用下过表达miR-221-3p的PC9细胞凋亡率降低，而PC9/GR和低表达miR-221-3p的凋亡细胞比例增加，A549的凋亡比例变化不大. 数据库预测miR-221-3p的下游靶基因可能是/p27、DKK2和PTEN，与此相比，miR-221表达上调的A549细胞中三个预测靶基因的表达水平没有变化菌株（DKK2 为 p=0.@ >076，PTEN 为 p=0.2519，/p27) 为 p=0.6121，以及 PC9/GR 和细胞的构建与下调的miR-221表达相似，与该菌株相比，与靶基因相比，靶基因的表达水平明显升高。WB蛋白水平验证进一步证实A549细胞/p27、DKK2和PTEN的蛋白含量在改变miR-221表达前后没有明显变化。而在PC9和PC9/GR细胞中/p27的蛋白含量在改变miR-221的表达前后没有明显变化，但DKK2和PTEN的蛋白含量变化明显。细胞中三种蛋白质的含量均发生显着变化（p=0.0183 for /p27, p= 0.0074 for PTEN, p=0.0165 for DKK2)@ >。但DKK2和PTEN的蛋白质含量发生了显着变化。细胞中三种蛋白质的含量均发生显着变化（p=0.0183 for /p27, p= 0.0074 for PTEN, p=0.0165 for DKK2)@ >。但DKK2和PTEN的蛋白质含量发生了显着变化。细胞中三种蛋白质的含量均发生显着变化（p=0.0183 for /p27, p= 0.0074 for PTEN, p=0.0165 for DKK2)@ >。

沉默PC9、MTT和流式细胞仪三个靶基因显示PC9在沉默PTEN和DKK2后获得耐药性（.98倍，3.35倍），而沉默/p27后无显着性药物敏感性的变化。双荧光素酶报告基因检测显示 PTEN 和 DKK2 基因是 miR-221-3p 的下游靶基因。结论：miR-221-3p在肺癌耐药细胞系PC9/GR中高表达，PTEN和DKK2是miR-221-3p的靶基因，miR-221-3p通过下调诱导EGFR外显子19或21 PTEN 和 DKK2。外显子突变细胞产生耐药性。