：背景铁死亡诱导剂拉非尼诱导肝癌细胞凋亡

[摘要]：背景铁死亡（）是新发现的一种以铁依赖性过氧化物积累为特征的程序性细胞死亡（cell，PCD）。其形态特征是细胞体积缩小、线粒体膜密度增加，是一种不同于典型的细胞凋亡和其他程序性细胞死亡的新型细胞死亡方式。铁死亡诱导剂可分为两大类：第一类诱导剂包括柳氮磺吡啶和亚砜亚胺等，这类诱导剂抑制Xc-（谷氨酸和胱氨酸）的反应。)作用，降低细胞内谷胱甘肽(，GSH)的含量，诱发细胞氧化还原失衡；第二类诱导剂包括RSL3、DPI7、等一系列合成化合物，此类诱导剂直接抑制谷胱甘肽过氧化物酶4(4, GPX4) 也会导致细胞中过氧化物的积累。最终，这取决于细胞中的铁离子。代谢异常，活性氧（ROS）的积累导致铁死亡。此外，一些药物如索拉非尼和青蒿素及其衍生物也证实了铁死亡。肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一。

最新数据显示，肝癌发病率已上升至第六位，死亡率高达第三位。我国是乙肝大国，肝硬化是乙肝患者的终末期，HCC是肝硬化患者的主要死亡原因。已有研究证实，索拉非尼诱导肝癌细胞的死亡方式是铁死亡，而非细胞凋亡。这为我们探索 HCC 开辟了新的研究方向。Xc-将细胞内的谷氨酸转运至细胞外，并将胞外胱氨酸转运至细胞内。这些胱氨酸再转化为半胱氨酸，为谷胱甘肽合成提供原料。保持细胞中一定浓度的谷胱甘肽对于保护细胞免受氧化应激至关重要。由于谷胱甘肽是GPX4酶分解过氧化物反应必不可少的辅助因子，消耗谷胱甘肽会显着降低GPX4酶的活性，使细胞内和脂质活性氧簇水平升高，从而导致铁死亡的发生。研究表明，电压依赖性阴离子通道、p53蛋白、血红素加氧酶-1等已知信号通路，如：MVA通路、热休克因子1-热休克蛋白B1通路、p62--NRF2通路等均参与在铁死的过程中，不同环节有不同程度的死亡。然而，铁死亡研究的信号通路网络尚未构建和成熟，深入研究仍有待我们完善。本研究将探讨诱导 HCC 细胞铁死亡的相关机制。

利用质粒转染选择性干扰相关因子的表达，进而检测其他相关因子的影响。最后，在动物实验中再次验证了上述细胞实验中的相关推论。本研究通过探索铁死亡参与肝癌细胞死亡的过程，为肝癌的临床治疗提供了新的思路，也为索拉非尼耐药的研究提供了一些经验。1受体保护HCC细胞免于铁死亡的研究目的第一部分：探讨1受体在具有铁死亡的肝癌（肝细胞癌）细胞中的作用。材料与方法：在4个HCC细胞系中，设置时间梯度检测空白对照组中1个受体（1，S1R）蛋白的表达，索拉非尼作用下24h组和48h组。免疫荧光显微镜观察S1R与Huh-7细胞各组细胞核的位置关系。下调p53、缺氧诱导因子1α（- 1-，HIF1α）和红细胞源性核因子2相关因子（2- 2，NRF2)，检测索拉非尼诱导的各组S1R mRNA水平不同，通过不同方式下调NRF2（RNAi或拮抗剂），进一步检测索拉非尼诱导各组S1R蛋白水平的差异。

采用两种sh RNA下调S1R，检测各组细胞活力和克隆形成情况。在不同S1R配体（激动剂或拮抗剂）作用下，检测各组在索拉非尼诱导铁死亡过程中细胞活性的差异。S1R被sh RNA下调，铁死亡过程中各组细胞GSH、Fe2+和丙二醛水平，以及铁代谢相关蛋白GPX4、NRF2和血红素加氧酶1的水平（heme 1,HO-1)其他基因的表达。最后在小鼠体内实验，验证了下调S1R对铁死亡的影响。结果：1.索拉非尼作用于四个HCC 细胞系和显着诱导 S1R 蛋白表达的时间依赖性增加 (P0.05). 在免疫荧光中，位于细胞核内的几乎所有S1Rs都转移到远离细胞核的位置，-1完全阻断了这种易位。2.HIF1α、p53、NRF2和S1R mRNA水平在索拉非尼作用下无明显变化（P0.05)。下调NRF2，显着增加mRNA水平S1R 的表达（P0.05)；同时下调 p53 和 HIF1α，未观察到相同的显着变化（P0.05)。此外，向下-调节NRF2在索拉非尼作用下显着增加S1R蛋白表达（P0.05)。另外，两种NRF2抑制剂也实现了相同的S1R蛋白表达增加效果（P< @0.05)。几乎所有位于细胞核内的S1Rs都转移到了远离细胞核的位置，-1完全阻断了这种易位。2.HIF1α、p53、NRF2和S1R mRNA水平在索拉非尼作用下无明显变化（P0.05)。下调NRF2，显着增加mRNA S1R 的表达（P0.05)；同时下调 p53 和 HIF1α，未观察到相同的显着变化（P0.05)。此外，向下-调节NRF2在索拉非尼作用下显着增加S1R蛋白表达（P0.05)。另外，两种NRF2抑制剂也实现了相同的S1R蛋白表达增加效果（P< @0.05)。几乎所有位于细胞核内的S1Rs都转移到了远离细胞核的位置，-1完全阻断了这种易位。2.HIF1α、p53、NRF2和S1R mRNA水平在索拉非尼作用下无明显变化（P0.05)。下调NRF2，显着增加mRNA S1R 的表达（P0.05)；同时下调 p53 和 HIF1α，未观察到相同的显着变化（P0.05)。此外，向下-调节NRF2在索拉非尼作用下显着增加S1R蛋白表达（P0.05)。另外，两种NRF2抑制剂也实现了相同的S1R蛋白表达增加效果（P< @0.05)。-1 完全阻断了这种易位。2.HIF1α、p53、NRF2和S1R mRNA水平在索拉非尼作用下无明显变化（P0.05)。下调NRF2，显着增加mRNA S1R 的表达（P0.05)；同时下调 p53 和 HIF1α，未观察到相同的显着变化（P0.05)。此外，向下-调节NRF2在索拉非尼作用下显着增加S1R蛋白表达（P0.05)。另外，两种NRF2抑制剂也实现了相同的S1R蛋白表达增加效果（P< @0.05)。-1 完全阻断了这种易位。2.HIF1α、p53、NRF2和S1R mRNA水平在索拉非尼作用下无明显变化（P0.05)。下调NRF2，显着增加mRNA S1R 的表达（P0.05)；同时下调 p53 和 HIF1α，未观察到相同的显着变化（P0.05)。此外，向下-调节NRF2在索拉非尼作用下显着增加S1R蛋白表达（P0.05)。另外，两种NRF2抑制剂也实现了相同的S1R蛋白表达增加效果（P< @0.05)。此外，两种 NRF2 抑制剂也实现了 S1R 蛋白表达的相同增加。效果 (P0.05). 此外，两种 NRF2 抑制剂也实现了 S1R 蛋白表达的相同增加。效果 (P0.05).

3. 细胞活力实验和克隆形成实验均表明S1R的下调显着促进了索拉非尼对HCC细胞的杀伤作用（P0.05)。两种S1R拮抗剂也显着这个过程被促进了，但是另一种S1R激动剂没有明显作用（P0.05)。4.铁死亡抑制剂-1非选择性抑制包括索拉非尼在S1R中的杀伤作用HCC 细胞上的敲低组（P0.05)，而 ZVAD-FMK 和 ZVAD-FMK 没有相同的效果（P0.05)。在 HCC S1R敲低组细胞中，GSH、Fe2+和丙二醛水平较对照组显着升高（P0.05)。相似性为，两种S1R拮抗剂也取得了同样的效果（P0.05).5.在索拉非尼的作用下，铁蛋白重链1（1，FTH1)和转移受体蛋白1( 1, TFR1) mRNA水平较对照组显着升高(P0.05),同时敲低S1R抑制了这种升高(P0.0< @5). 与对照组相比，S1R 的下调抑制了索拉非尼诱导的 HO-1 和 GPX4 mRNA 的增加（P0.05)。与对照组相比，下调S1R抑制索拉非尼诱导的GPX4蛋白升高（P0.05)，而NRF2蛋白水平无显着变化（P0.05).铁蛋白重链 1 (1,FTH1) 和转移受体蛋白 1(1, TFR1)) mRNA 水平与对照组相比显着增加 (P0.05),同时敲低S1R抑制了这种增加（P0.05)。与对照组相比，S1R的下调抑制了索拉非尼诱导的HO-1和GPX4 mRNA的增加（P0. 05). 与对照组相比，下调S1R抑制了索拉非尼诱导的GPX4蛋白升高（P0.05)，而NRF2蛋白水平无显着性差异）变化（P0.05).铁蛋白重链 1 (1,FTH1) 和转移受体蛋白 1(1, TFR1)) mRNA 水平与对照组相比显着增加 (P0.05),同时敲低S1R抑制了这种增加（P0.05)。与对照组相比，S1R的下调抑制了索拉非尼诱导的HO-1和GPX4 mRNA的增加（P0. 05). 与对照组相比，下调S1R抑制了索拉非尼诱导的GPX4蛋白升高（P0.05)，而NRF2蛋白水平无显着性差异）变化（P0.05).同时敲低S1R抑制了这种增加（P0.05)。与对照组相比，S1R的下调抑制了索拉非尼诱导的HO-1和GPX4 mRNA的增加（P0. 05). 与对照组相比，下调S1R抑制了索拉非尼诱导的GPX4蛋白升高（P0.05)，而NRF2蛋白水平无显着性差异）变化（P0.05).同时敲低S1R抑制了这种增加（P0.05)。与对照组相比，S1R的下调抑制了索拉非尼诱导的HO-1和GPX4 mRNA的增加（P0. 05). 与对照组相比，下调S1R抑制了索拉非尼诱导的GPX4蛋白升高（P0.05)，而NRF2蛋白水平无显着性差异）变化（P0.05).而NRF2的蛋白水平没有显着变化（P0.05).而NRF2的蛋白水平没有显着变化（P0.05).

Miro RNA-214的第二部分通过靶向肝癌细胞中的ATF4来调节铁。死亡研究的目的：探讨RNA-214调控肝癌细胞铁死亡的机制。材料与方法：检测两种肝癌细胞系在不同浓度和相关抑制剂作用下的细胞活力，验证铁死亡。构建RNA -214稳定过表达和敲低细胞系，并使用Real-time PCR进行验证。分别测试过表达和敲低RNA-214，以比较对照组的细胞活力和细胞克隆形成。测试了 RNA-214。表达对铁死亡诱导肝癌细胞脂质代谢的影响。材料与方法：检测两种肝癌细胞系在不同浓度和相关抑制剂作用下的细胞活力，验证铁死亡。构建RNA -214稳定过表达和敲低细胞系，并使用Real-time PCR进行验证。分别测试过表达和敲低RNA-214，以比较对照组的细胞活力和细胞克隆形成。测试了 RNA-214。表达对铁死亡诱导肝癌细胞脂质代谢的影响。材料与方法：检测两种肝癌细胞系在不同浓度和相关抑制剂作用下的细胞活力，验证铁死亡。构建RNA -214稳定过表达和敲低细胞系，并使用Real-time PCR进行验证。分别测试过表达和敲低RNA-214，以比较对照组的细胞活力和细胞克隆形成。测试了 RNA-214。表达对铁死亡诱导肝癌细胞脂质代谢的影响。分别测试过表达和敲低RNA-214，以比较对照组的细胞活力和细胞克隆形成。测试了 RNA-214。表达对铁死亡诱导肝癌细胞脂质代谢的影响。分别测试过表达和敲低RNA-214，以比较对照组的细胞活力和细胞克隆形成。测试了 RNA-214。表达对铁死亡诱导肝癌细胞脂质代谢的影响。

检测RNA-214过表达对激动转录因子4（4，ATF4)及下游分子）的影响。双荧光素实验验证RNA-214可靶向调控工具细胞（293T）中的ATF4。通过检测细胞活力、克隆实验、丙二醛和ROS产生探讨ATF4过表达对RNA-214过表达介导的铁死亡的影响。并检测肿瘤组织中相关基因的表达结果：1.随着浓度的增加，肝癌细胞的活性显着降低（P0.05)，而这种降低可以是-1抑制（P0.05),但不能被其他抑制剂抑制（P0.05)。构建的稳定转染细胞系的表达有显着差异（P0.05)。与对照组在作用下，OV-pre-mi R-214组细胞活力显着降低（P0.05)，而在anti-mi R-214-3p组，细胞活性显着增加（P0.05)。作用下，细胞克隆形成率显着降低（P0.05)，OV- pre-mi R-214组进一步降低克隆形成率（P0.05)，而anti-mi R-214-3p组克隆形成率显着增加（P< @0.05)) ( P0.05).构建的稳定转染细胞系的表达有显着差异（P0.05)。与对照组相比，OV-pre-mi R-214组在作用下的细胞活力显着降低（P0.05)，而在anti-mi R-214-3p组中，细胞活性显着增加（P0.05)。下作用下，细胞克隆形成率显着降低（P0.05)，OV-pre-mi R-214组进一步降低了克隆形成率（P0.0< @5)，而anti-mi R-214-3p组克隆形成率显着增加（P0.05)）（ P0.05)。构建的稳定转染细胞系的表达有显着差异（P0.05)。与对照组相比，OV-pre-mi R-214组在作用下的细胞活力显着降低（P0.05)，而在anti-mi R-214-3p组中，细胞活性显着增加（P0.05)。下作用下，细胞克隆形成率显着降低（P0.05)，OV-pre-mi R-214组进一步降低了克隆形成率（P0.0< @5)，而anti-mi R-214-3p组克隆形成率显着增加（P0.05)）（ P0.05)。与对照组相比，在作用下，OV-pre-mi R-214组细胞活力显着降低（P0.05)，而在anti-mi R-214 -3p组，细胞活性显着增加（P0.05)。作用下，细胞克隆形成率显着降低（P0.05)， OV-pre-mi R-214组进一步降低克隆形成率（P0.05)，而anti-mi R-214-3p组克隆形成率显着增加（ P0.05)) ( P0.05).与对照组相比，在作用下，OV-pre-mi R-214组细胞活力显着降低（P0.05)，而在anti-mi R-214 -3p组，细胞活性显着增加（P0.05)。作用下，细胞克隆形成率显着降低（P0.05)， OV-pre-mi R-214组进一步降低克隆形成率（P0.05)，而anti-mi R-214-3p组克隆形成率显着增加（ P0.05)) ( P0.05).作用下，细胞克隆形成率显着降低（P0.05)，OV-pre-mi R-214组进一步降低了克隆形成率（P0.0 5)，而anti-mi R-214-3p组克隆形成率显着增加（P0.05)）（ P0.0<@ 5)。作用下，细胞克隆形成率显着降低（P0.05)，OV-pre-mi R-214组进一步降低了克隆形成率（P0.0 5)，而anti-mi R-214-3p组克隆形成率显着增加（P0.05)）（ P0.0<@ 5)。

2.显着升高肝癌细胞中丙二醛、Fe2+和ROS水平，而OV-pre-mi R-214组在肝癌细胞作用下进一步升高丙二醛、Fe2+和ROS水平（ P 0.05). 显着降低肝癌细胞GSH浓度，OV-pre-mi R-214组在作用下进一步降低肝癌细胞GSH浓度（P<@ 0.05).3.显着促进肝癌细胞中ATF4和热休克蛋白5A(heat,)的表达，而OV-pre-mi R-214组抑制ATF4和荧光素酶的表达(P0.05)。ATF4 3'UTR+mi R-214组的荧光素酶活性显着低于'UTR+NC组，而ATF4 3'UTR逆转了这种变化(P0.05).4. 与对照组相比，ATF4的过表达增加了肝癌细胞在作用下的细胞活力和克隆形成率，降低了作用下丙二醛浓度和ROS水平(P0.05).5.与对照组相比,OV-pre-mi R-214组进一步降低裸鼠肿瘤的体积（P0.05).与对照组相比，OV-pre-mi R-214组进一步减小了裸鼠肿瘤体积(P0.05).与对照组相比，OV-pre-mi R-214组进一步减小了裸鼠肿瘤体积(P0.05).

与对照组相比，OV-pre-mi R-214组肿瘤中Mi R-214-3P mRNA水平升高，ATF4 mRNA和蛋白表达水平降低（P0.0 5). 结论：MIR-214参与了肝癌细胞铁死亡的诱导，过表达MIR-214会加剧铁死亡过程。MIR-214通过调节丙二醛、Fe2+、GSH和ATF4 过程。