酪氨酸耐药PLC和Huh7细胞系中茎样尼的免疫印迹分析检测

概括

酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼在晚期肝细胞癌 (HCC) 患者中的使用经常受到耐药性发展的阻碍，最近已证明耐药性与癌症干细胞 (CSC) 亚群的出现有关。然而，尚不清楚表观遗传机制，尤其是组蛋白的翻译后修饰，是否与索拉非尼耐药 HCC 中茎样特征的维持存在因果关系。在这项研究中，我们报告了赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶 1A（或 LSD1) 的活性是长期索拉非尼治疗后癌症干细胞出现所必需的。因此，抑制剂，例如和，显着抑制干细胞索拉非尼耐药 HCC 细胞的细胞特性。

研究成果

图1

图 1：在索拉非尼耐药细胞中诱导干细胞样细胞群需要去甲基化酶活性。

A：描述本研究中建立耐索拉非尼 PLC 和 Huh7 细胞系的实验方案的示意图模型。

B：对照或索拉非尼耐药细胞中干细胞标志物的蛋白质印迹分析。该图显示了来自亲本和索拉非尼耐药 PLC 和 Huh7 细胞系的代表性数据。

C：在干细胞培养基中由亲本或索拉非尼抗性细胞产生的代表性漂浮肿瘤球。显示了平均球体直径的量化。

D：由亲本或索拉非尼抗性 PLC 和 Huh7 细胞产生的球体的定量，显示为每 2,000 个细胞形成的球体数量。

E：亲本和索拉非尼耐药 PLC 和 Huh7 细胞系中 Lgr5+ 细胞百分比的流式细胞术分析。

F：使用来自亲本细胞和索拉非尼抗性细胞的全细胞裂解物通过蛋白质印迹分析检测多个组蛋白甲基标记物的水平。

G：通过蛋白质印迹分析从索拉非尼耐药细胞的异位表达的对照或裂解物中检测干细胞标志物的表达。

H：索拉非尼耐药细胞的对照或异位表达的细胞活力。与索拉非尼孵育 24 小时。

图2

图 2：它对于在索拉非尼耐药的肝癌细胞中诱导干细胞样群至关重要。

A：表达索拉非尼的对照或细胞中干细胞标志物的印迹分析。该图显示了来自索拉非尼耐药 PLC 和 Huh7 细胞系的代表性数据。

B：对照细胞活力或索拉非尼抗性细胞的表达，用索拉非尼处理 24 小时。

C：本研究中使用的野生型 (WT) 和突变体的域结构示意图，突出显示组蛋白去甲基化酶活性不足的 -(赖氨酸-丙氨酸) 突变。通过免疫印迹分析证实稳定重新引入的-WT或-在耗尽索拉非尼抗性的HCC细胞中的表达水平。

D：在干细胞培养基中稳定表达-WT或-培养的耗竭的索拉非尼抗性HCC细胞球状化的量化。

E：在干细胞培养基中稳定表达-WT或-培养的耗竭的索拉非尼抗性HCC细胞中产生的Lgr5+细胞百分比的流式细胞术分析。

F：在含血清培养基中稳定表达-WT或-的耗竭的索拉非尼抗性HCC细胞的细胞增殖曲线。

图 3

图 3：组蛋白去甲基化酶活性的抑制诱导索拉非尼耐药细胞分化并削弱干细胞特性。

A、B：用抑制剂或治疗剂处理的索拉非尼耐药细胞中干细胞的相对 mRNA 水平和分化标志物的 qRT-PCR 分析。

C、D：对索拉非尼耐药细胞处理的抑制剂或干细胞的表达和分化标志物进行蛋白质印迹分析。

E、F：用抑制剂或治疗剂处理的索拉非尼抗性细胞的平均球形直径的定量分析。

G：用指定浓度的抑制剂处理的索拉非尼抗性细胞产生的球体的定量。

H：用指定浓度的抑制剂处理的索拉非尼耐药细胞系 Lgr5+ 细胞百分比的流式细胞术分析。

图 4

图 4：抑制剂重新激活多个 Wnt 抑制剂的转录并下调索拉非尼耐药细胞中的 β 信号通路。

A、B：在有或没有抑制剂的情况下孵育的索拉非尼耐药 PLC 细胞中 APC 和 mRNA 水平的 qRT-PCR 分析。

C：使用芯片法检测索拉非尼耐药PLC细胞中启动子上和/2的丰度。

D、E：蛋白质印迹分析、Apc 和、和、a-β- 和 t-β- 在索拉非尼耐药 pc 细胞中的表达，有或没有或处理。

F：相对 TOP/FOP 活性 (%) 表明 β- 信号通路的活性在经处理的索拉非尼耐药 PLC 细胞中降低。

图5

图 5：靶向通过部分抑制 Wnt/β 信号传导，使耐药干细胞对索拉非尼重新敏感。

A、B：在存在或不存在 Wnt 激活剂的情况下，将 PLC 索拉非尼抗性细胞与球体大小和数量一起孵育。

C、D：细胞计数试剂盒 8 测量在存在或不存在 Wnt 激活剂的情况下用和/或索拉非尼处理的 PLC 和 Huh7 索拉非尼抗性细胞的细胞增殖。

E.，F：在存在或不存在 Wnt 激活剂的情况下，由索拉非尼抗性干 PLC 和 Huh7 细胞与索拉非尼和/或索拉非尼一起温育形成的集落数。

图 6

图 6：抑制剂在体内使耐药干细胞对索拉非尼敏感。

A：裸鼠皮下异种移植瘤的代表性图像是由对索拉非尼有抗性的 PLC 细胞形成的，用 和索拉非尼或不用索拉非尼处理。植入六周后，解剖并显露皮下异种移植物。

B：在裸鼠中由索拉非尼抗性 PLC 细胞形成的皮下异种移植物的生长曲线。

C：在用抑制剂和/或索拉非尼组合治疗的小鼠中由索拉非尼抗性肝癌细胞产生的皮下异种移植物中 Lgr5+ 细胞百分比的流式细胞术分析。

D：在和/或治疗后，裸鼠中索拉非尼耐药 pc 细胞形成的异种移植物中 Wnt/β 信号表达的蛋白质印迹分析。

综上所述

综上所述，这些发现表明抑制剂可用于减轻索拉非尼的获得性耐药，从而提高索拉非尼对HCC患者的治疗效果。

DOI：10.1016/j..2017.03.038

参考

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