EGFR基因突变占EGFR突变类型突变约占45％左右

在细胞质中，P40和P63阳性细胞在细胞核中染色；各代肿瘤组织染色基本一致；上述结果表明，肿瘤组织具有良好的生长潜力，且通道相对稳定。

[0028]在EGFR基因分子评价方面，现有的“人EGFR基因突变检测试剂盒”主要是通过相对成熟的荧光对肿瘤组织的DNA进行EGFR(表皮生长因子受体)基因突变检测。 PCR技术。网站分析。

[0029]EGFR基因位于人7号染色体短臂（7pl2)，全长约118 kb，由28个外显子组成；其转录形成的mRNA约5. 6 kb，编码一个分子量为170 kD的跨膜糖蛋白，胞内区具有酪氨酸激酶（，TK）活性，负责将胞外信号传递到细胞内，异常的EGFR活化可促进肿瘤的增殖和迁移细胞、分化、血管生成，并能抑制肿瘤细胞凋亡。

[0030]EGFR基因突变主要发生在细胞内TK区的前4个外显子(18~21个外显子)。研究表明：EGFR基因18、19、20、外显子21突变的肺癌患者，对酪氨酸激酶抑制剂（，TKIs）有较好的疗效。在中国肺癌患者中，EGFR的突变率约为30%-50%，其中18外显子点突变约占EGFR突变类型的5%，19外显子多缺失突变约占5% EGFR突变。约占EGFR突变类型的45%，外显子20的点突变约占EGFR突变类型的1%，外显子21的点突变约占EGFR突变类型的40%~45%。

[0031] 在上述已有研究的基础上，具体分析过程如下：按照现有技术，进行常规操作，提取肿瘤组织样本的DNA； EGFR基因外显子18、19、21和20的定性分析如下表：

ο

[0032] 已知吉非替尼敏感性非小细胞癌模型的EGFR突变类型有：、、、、缺失，据此可筛选吉非替尼敏感性非小细胞癌PDX模型。

[0033]实施例3 在上述实施例1、2的基础上，本发明人筛选得到了肿瘤生长临界值为EGFR突变类型为该PDX的非小细胞肺癌PDX模型用吉非替尼诱导模型获得吉非替尼耐药的非小细胞肺癌PDX模型。

[0034]筛选获得的非小细胞肺癌PDX模型，采用第三代移植瘤小鼠诱导构建吉非替尼耐药移植瘤模型；具体过程如下： 将小鼠分为两组，一组为对照组，另一组为实验组。阳性对照组给予吉非替尼溶液，每天/kg，连续灌胃1周后肿瘤体积明显缩小（阳性对照组）。建立意义： 1.确认实施例2中选择基因型的移植瘤对吉非替尼敏感。 2.确认诱导吉非替尼耐药前的移植肿瘤对吉非替尼敏感）；实验组给予吉非替尼溶液，剂量依次为低剂量（10mg/kg）、中剂量（50mg/kg）、高剂量（/kg）。

[0035] 需要说明的是，吉非替尼的剂量设定依据为：按照人剂量，吉非替尼换算成大鼠的剂量约为50mg/kg；而在目前的文献报道中，吉非替尼在黑质诱导的吉非替尼耐药细胞异种移植实验中，给小鼠注射吉非替尼的剂量为/kg，因此/kg作为吉非替尼耐药非小剂量的标准剂量。细胞肺癌 取其1/10作为初始剂量，即10 mg/kg，逐渐增加剂量，诱导获得性非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型。

[0036] 需要说明的是，由于实验组小鼠最终可能不会对吉非替尼产生耐药性，因此实验组每组小鼠的数量建议至少不少于10只；发明人的实验过程中间实验每组小鼠12只。

[0037] 另外需要说明的是，实验时灌胃用吉非替尼溶液的制备方法如下：将含有吉非替尼的片剂称重，记为A；将替尼片研磨成粉末，收集粉末于50mL离心管中称重，记为B；计算吉非替尼的实际用量，公式为：（A/B）X；溶解在生理盐水中并分装成小的单剂量体积；然后在-20°C冷冻保存。

[0038]阳性对照组实验基于筛选得到的吉非替尼敏感性非小细胞癌PDX模型。将肿瘤组织样本植入小鼠体内后，定期观察并记录肿瘤组织的生长情况。阳性对照组 当体内移植瘤组织长到100~时，每天灌胃吉非替尼（/kg），对照组移植瘤会越来越小，1~ 3周。肿瘤生长曲线见图5。从图5的结果可以看出，上述筛选得到的非小细胞癌PDX模型的肿瘤组织对吉非替尼非常敏感。

[0039]吉非替尼诱导组的详细实验过程如下。

[0040] 将低剂量（10mg/kg）吉非替尼诱导过程获得的吉非替尼敏感性非小细胞癌PDX模型植入小鼠肿瘤组织样本中，定期观察并记录肿瘤组织的生长情况，当体内移植的肿瘤组织长到100~，实验组开始每天灌胃吉非替尼溶液（10mg/kg）。灌胃后正常喂养，定期观察记录移植瘤的生长和大小。这些小鼠被记录为第一代吉非替尼治疗小鼠。

[0041]对于实验组小鼠，根据情况需要间断给药；给药原则是：给药后，当肿瘤组织停止生长时，需要停止灌胃吉非替尼。但当肿瘤组织开始生长并再次生长时，应再次灌胃给予吉非替尼。记录吉非替尼给药至停止给药的时间为治疗时间，停止吉非替尼至肿瘤组织再次生长的时间记录为停止时间。一个治疗时间和一个停止时间合并为一个治疗周期。

[0042] 对于实验组小鼠，在初始阶段，在一个治疗周期内，治疗时间约为4～5天，停药时间约为10天。但随着肿瘤组织的增大，每个治疗周期的治疗时间会变长，停药时间会变短。

[0043]在最后一个周期，在每天连续给药的情况下，肿瘤可以长到(直径约1cm)的通过体积，整个过程大约需要1～2个月；在诱导过程结束时，可以认为筛选得到的吉非替尼敏感性非小细胞癌PDX模型对小剂量吉非替尼产生了耐药性。

[0044]需要说明的是，在耐药诱导过程中，不同来源的肿瘤组织对吉非替尼的敏感性不同。一些来源可耐受 3 到 5 个治疗周期。

[0045]还需要说明的是，本例治疗结束时的肿瘤体积为，但治疗结束时不同肿瘤组织的体积可能不同，这是个体差异造成的例如，有些肿瘤组织在达到1500 mm3时质地良好，而有些肿瘤组织在未达到500 mm3时就会坏死；因此，前3代应密切观察肿瘤组织的生长周期和生长特征。肿瘤组织生长到最大，没有坏死组织，就是治疗终止时的体积（本实施中使用的肿瘤生长体积临界点为)〇

[0046] 小剂量诱导后处死小鼠取出肿瘤组织，将部分肿瘤组织（称为第一代吉非替尼耐药肿瘤组织）冷冻保存，部分肿瘤组织传代后对吉非替尼耐药的小鼠进行传代（这一代小鼠称为第二代吉非替尼治疗小鼠）。

[0047] 冷冻保存方法：将组织切成直径5~6mm的组织块（约0.2~0.3g），将组织块预先放入1mL冷冻箱中保存冷冻管中的液体，使低温溶液能够完全覆盖组织；然后将其放入程序冷冻箱中，将其放入-80°C冰箱中过夜，然后将其储存在液氮中。

[0048]组织冷冻保存液的制备：50%胎牛血清、40%L-15溶液、10%DMSO。

[0049] 冻存组织复苏法：将液氮冷藏的肿瘤组织在植入小鼠体内之前，需要经过组织复苏阶段。具体过程是：取出冷冻的组织块，在恒温水浴中解冻后，将组织块置于培养皿中，用含有青霉素和链霉素的PBS洗涤两次，然后通过皮下移植植入小鼠体内。

[0050]中剂量(50mg/kg)吉非替尼诱导过程将第一代吉非替尼耐药肿瘤组织植入小鼠体内后，定期观察并记录小鼠体内肿瘤的生长过程。当第二代吉非替尼治疗小鼠的肿瘤组织长到100~时，每两天灌胃给予中等剂量吉非替尼（50mg/kg）溶液，观察肿瘤组织的大小和生长情况。每天记录。

[0051] 在给药过程中，也采用间歇给药方式，即：当肿瘤组织停止生长时，停止给药；当肿瘤组织长到300-400 mm3时，再次给予吉非替尼。 (50mg/kg) 灌胃。

中剂量诱导过程：在第一个治疗周期，给药时间约为6～10天（给药方式为：每两天给药一次，具体给药时间根据给药间隔计算，为比如两天给药，治疗10天，是第一次2、4、6、8、给药10天），停药时间10~ 15 天。

[0053] 2～4个治疗周期后，每两天灌胃模式的小鼠已经开始对50mg/kg的剂量产生耐受（这种灌胃模式的耐受标准是，在这种情况下）给药类型，肿瘤生长不受给药剂量影响，肿瘤体积开始增大）；此时改变给药方式，增加给药次数，每天灌胃吉非替尼溶液（5