抗VEGF单克隆抗体靶向药物贝伐珠单抗的疗效及作用机制

目的：通过移植瘤动物实验，探讨奥希替尼联合抗VEGF单克隆抗体靶向药物贝伐单抗的疗效及作用机制，为进一步的临床试验提供理论依据。

方法：构建EGFR突变的人肺腺癌移植瘤动物模型。

实验组：小剂量奥希替尼组、高剂量奥希替尼组、小剂量奥希替尼联合贝伐珠单抗组、高剂量奥希替尼联合贝伐单抗组。每组5只，给药方式：奥希替尼2.5 mg/kg/d或5 mg/kg/d，每天灌胃治疗；贝伐单抗5mg/kg，每周2次腹腔注射。在接种后和给药期间绘制肿瘤生长曲线。给药后2周处死裸鼠，对整个肿瘤进行活检。免疫组化SP法检测肿瘤HIF-1α、VEGF和微血管密度（MVD）。使用印迹法检测EGFR及其下游AKT和ERK信号通路蛋白的表达。

结果：给药2周后，高剂量奥希替尼单药组和小剂量奥希替尼单药组肿瘤体积明显缩小，HIF-1α、VEGF、MVD表达率显着降低（P0. 05）。大剂量奥希替尼联合组与大剂量奥希替尼单药组体积差异无统计学意义（P=0.64< @2）.两个组合组体积差异无统计学意义（P=0.07<@2），以上因素表达差异无统计学意义（P>0.05）。

结论：贝伐单抗可显着提高奥希替尼对EGFR突变肺腺癌异种移植瘤的杀伤能力。贝伐珠单抗与奥希替尼的协同作用是通过降低肿瘤中VEGF的表达，改善肿瘤微环境，增强对EGFR下游信号通路激活的抑制来实现的。

关键词：非小细胞肺癌 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 抗血管生成治疗 肿瘤微环境

肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，其中85%为非细胞肺(non-,)[1]。化疗联合抗血管生成靶向药物可显着延长非鳞癌患者的总生存期（，OS）[2-5]。近年来，个体化分子靶向治疗取得了巨大成功。对于EGFR敏感突变（外显子19缺失[E19 d​​el]和外显子21点突变[E21]），使用第一代或第二代EGFR-TKI治疗相比传统化疗可以显着改善患者的健康预后。

AURA-3 III期临床研究显示，在EGFR-TKI进展并获得性突变的患者中，奥希替尼的客观缓解率（rate，ORR）高达71%，中位无进展生存期（免费，mPFS) ) 10.1 个月 [6]。

血管内皮生长因子 (VEGF) 在血管生成中起重要作用，是肿瘤内皮细胞存活所必需的。贝伐珠单抗可降低VEGF水平以阻断血管生成，使肿瘤曲折的血管暂时正常化，提高肿瘤氧含量和降低间质液压力，恢复对肿瘤的药物输送，这可能使肿瘤细胞对血管更敏感。II期临床试验表明，与单药厄洛替尼相比，厄洛替尼联合贝伐珠单抗可显着延长EGFR敏感突变患者的mPFS（16个月对比9.7个月）。对于单纯EGFR敏感突变、EGFR敏感突变和肺癌突变患者，厄洛替尼联合贝伐珠单抗一线治疗PFS显着延长（16个月vs. 1<

本研究构建突变型裸鼠肺癌异种移植模型，采用奥希替尼联合或不联合贝伐单抗进行干预，探讨肿瘤微环境变化对第三代EGFR-TKI治疗突变型肺癌的影响及相关的分子机制，为进一步的临床试验提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

人肺腺癌细胞系（EGFR E20）细胞系由四川大学华西医院赠送。实验动物为20只SPF雌性裸鼠BALB/C裸鼠（4-6周龄，约20g），购自北京华富康生物科技有限公司，实验动物许可证号SCXK（北京）2014-0004。实验经医院动物保护与应用委员会批准。

奥希替尼()购自美国公司；贝伐单抗购自瑞士罗氏；ECL Plus发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。免疫组化SP超敏试剂盒和DAB试剂盒购自北京中山金桥生物科技有限公司CD34、和HIF-1α抗体购自武汉博斯特生物工程有限公司EGFR、AKT、ERK和p-EGFR 、p-AKT、p-ERK购自美国Cruz公司，抗体购自美国公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及裸鼠移植瘤模型的建立

细胞在RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）中培养，在37℃、5%CO2、90%湿度的培养箱中培养，细胞贴壁。取对数生长期细胞，消化计数，2×10 6 个细胞/mL，接种于小鼠右后肢前侧腹壁皮下。大约 1 周后肿瘤开始形成，在接种疫苗后和给药期间至少每周测量两次肿瘤体积。

当小鼠肿瘤平均长到0.2～0.4 cm3时，随机分为4组： A组（Low-O）：小剂量奥希替尼组（n=5，< @2.5mg/kg/d)；B组（High-O）：大剂量奥希替尼组（n=5，5 mg/kg/d）；C组（Low-OB）：奥希替尼低剂量联合贝伐珠单抗给药组（n=5，奥替替尼2.5 mg/kg/d，贝伐单抗5 mg/kg，每周2次）；D组（High-OB）：奥希替尼高剂量联合贝伐珠单抗给药组（n=5，奥希替尼5mg/kg/d，贝伐珠单抗5mg/kg，每周2次二流）。当平均肿瘤体积达到0.4～0.6 cm3（肿瘤体积V=L×W2×π/6））时开始药物干预。给药方法：奥希替尼每日灌胃治疗，腹腔注射每周两次贝伐单抗。

1.2.2 免疫组化检测标准

活检组织在4%多聚甲醛溶液中固定48小时，然后脱水，石蜡包埋，切片。一抗兔抗小鼠CD34、，HIF-1α单克隆抗体，SP免疫组化染色，最后DAB显色，苏木精复染，封固。定期光镜观察表达，每片至少随机选择5个400倍视野，采用阳性细胞染色和染色强度双重评价的方法[8-9]。无阳性细胞记0分，阳性细胞比例≤10%记1分，阳性细胞比例11%-50%记2分，阳性细胞记1分。 51%-80%的细胞比例为3分，阳性细胞比例> 80%被评为3分；颜色没有或模糊的记0分，浅黄色的记1分，棕色的记2分，棕色的记3分。最终结果由两项相加决定：3分为弱阳性，4～5分为中等阳性，6～7分为强阳性。当阳性细胞比例为

1.2.3 印迹检测

将各组移植瘤标本冰水浴匀浆后裂解（加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度，用5×上样缓冲液充分混匀，煮沸3分钟，冰浴快速冷却，每泳道上样30 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜，小牛血清将蛋白封闭2 h，加入相应的一抗，4°C孵育过夜（作为内参）。洗涤后用二抗孵育，化学发光显色，用J分析各目的蛋白灰度值进行检测分析。

1.3 统计分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据表示为 x ± s。各组肿瘤体积、各样本灰度值、MVD、VEGF、HIF-1α表达比较均采用t检验。取P

2 结果

2.1 裸鼠移植瘤的生长情况

实验过程中，A、C、D组各死亡1只裸鼠，其余裸鼠情况良好。裸鼠移植瘤（图1），各组移植瘤生长曲线（图<@2），各组切除后移植瘤（图3）.肿瘤体积变化）各治疗组移植瘤裸鼠给药前和处死后（表1）.肿瘤细胞接种2. 5周后）（给药前）肿瘤体积无统计学差异治疗组（P>0.05）。给药2周后，

2.2 移植瘤裸鼠肿瘤组织中VEGF和HIF蛋白的表达及MVD免疫组化结果表明VEGF表达于肿瘤细胞的细胞质或细胞膜，而HIF-1α表达于细胞核（图4，5）。奥希替尼联合贝伐珠单抗组VEGF和HIF-1α的表达率低于单药组（P

联合贝伐珠单抗组的MVD低于单药组（单药治疗两组中，高剂量单剂量组和低剂量单药组MVD较低（P= 0.026）。

2.3 各组EGFR及其下游AKT、ERK通路蛋白的表达

用blot法检测各处理组蛋白结果（图中阳性细胞比例为51%～80%为3分，阳性细胞比例>80%为3分；无颜色者为或模糊的颜色为0分，浅黄色为1分，棕色为2分，棕褐色为3分。最终结果由加2分决定：3为弱阳性，4至5为中度阳性，6～7分为强阳性，当阳性细胞比例

1.2.3 采用blot法检测各组移植瘤标本。

在冰水浴中匀浆后，裂解（加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）以提取蛋白质。BCA法测定蛋白质浓度，用5×上样缓冲液充分混匀，煮沸3分钟，冰浴快速冷却，上样量为30 μg/泳道，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜，小牛血清中的蛋白质被封闭2 h，加入相应的一抗，4°C孵育过夜（作为内对照）。洗涤后用二抗孵育，化学发光显色，用J分析各目的蛋白灰度值进行检测分析。

1.3 统计分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据表示为 x ± s。各组肿瘤体积、各样本灰度值、MVD、VEGF、HIF-1α表达比较均采用t检验。取P

2 结果

2.1 裸鼠移植瘤的生长情况

实验过程中，A、C、D组各死亡1只裸鼠，其余裸鼠情况良好。裸鼠移植瘤（图1），各组移植瘤生长曲线（图<@2），各组切除后移植瘤（图3）.

各治疗组移植瘤裸鼠给药前和处死后肿瘤体积变化（表1）.肿瘤细胞接种2. 5周（给药前） 治疗间肿瘤体积无差异组间有统计学意义（P>0.05）。给药2周后，奥希替尼联合贝伐珠单抗的两组肿瘤体积均显着小于奥希替尼小剂量组（磷

▶A. 低剂量; B. 高剂量；C. 低剂量加；D. 大剂量加图1 各治疗组给药2周后移植瘤图6）。高剂量奥希替尼单药组p-EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白的表达显着低于低剂量奥希替尼组（单药组显着降低（P0.05）) @>。

3 讨论

研究表明，EGFR-TKIs获得性耐药后肿瘤VEGF水平会升高。提出耐药后肿瘤细胞对EGFR信号通路的依赖性会降低，对VEGF通路的依赖性会增加[10]。本研究表明，EGFR信号通路仍然是耐药突变肺癌细胞重要的生长依赖性信号通路。奥希替尼对 EGFR 及其下游 PI3K/AKT/mTOR 和 Ras-Raf-MAPK 信号通路具有抑制作用。改善肿瘤组织微环境，增强这两条信号通路的抑制作用，从而更有效地杀伤肿瘤细胞。

EGFR 和 VEGF 相关的信号通路在肿瘤的发展中起着至关重要的作用。EGFR异常激活导致肿瘤增殖加速且不受调控，VEGF信号通路与肿瘤血管生成有关。[11] 提出肿瘤血管生成依赖于“血管生成开关”的激活，这是最常见的 VEGF 亚型。与NRPs（神经元）结合后，触发并激活下游信号通路，促进血管内皮增殖和迁移。VEGF还可以增加微血管的通透性，还可以聚集循环内皮细胞前体、相关免疫细胞和间充质细胞，在肿瘤微环境的构建中发挥重要作用。

本研究观察到，随着奥希替尼剂量的增加，药物的抗肿瘤作用增强，与VEGF抗体联合后，奥希替尼的抗肿瘤作用也增强。从肿瘤生长曲线可以看出，贝伐单抗的协同抗肿瘤作用比加倍单剂量的效果更显着。提示适当剂量的奥希替尼联合抗血管治疗可能比单纯增加奥希替尼的剂量带来更大的益处。另一方面，这种联合作用可以减少单次增加药物剂量引起的剂量限制性毒性。当然，与贝伐单抗联合使用也会增加高血压和出血的风险。实验中，两个组合组各有1只小鼠死亡。需要说明的是，与小剂量奥希替尼组小鼠在实验后期因肿瘤负荷过重而死亡不同，联合组小鼠的死亡发生在贝伐单抗给药后的第3天。它是由药物本身或实验操作引起的。

本实验还观察到，奥希替尼联合贝伐珠单抗组的VEGF表达和微血管密度低于奥希替尼单药治疗组，但奥希替尼联合贝伐珠单抗组并非微血管密度所致。HIF-1α 的低表达和高表达。研究表明，HIF-1α可增强肿瘤细胞上皮间质转化，重建细胞外基质，诱导耐药性，并可增强肿瘤干细胞活性，协助肿瘤细胞免疫逃逸。本研究认为，贝伐单抗虽然抑制肿瘤血管生成，但改善了肿瘤的内部环境，从而改善了肿瘤组织的氧供应。这也符合 Jain 等人提出的抗血管生成治疗中血管的正常化。[13]：1周内，抗血管生成治疗可使曲折变形的血管更加正常，增加组织的含氧量。然而，治疗持续了2. 5 周，远远超出了血管正常化的时间窗口。[14] 认为 HIF-1α mRNA 和蛋白质的合成不仅依赖于氧气，而且很大程度上依赖于 PI3K 和 MAPK 通路。高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐珠单抗治疗组的PI3K和MAPK信号通路受到抑制，可以解释HIF-1α表达的降低。这远远超出了血管正常化的时间窗口。[14] 认为 HIF-1α mRNA 和蛋白质的合成不仅依赖于氧气，而且很大程度上依赖于 PI3K 和 MAPK 通路。高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐珠单抗治疗组的PI3K和MAPK信号通路受到抑制，可以解释HIF-1α表达的降低。这远远超出了血管正常化的时间窗口。[14] 认为 HIF-1α mRNA 和蛋白质的合成不仅依赖于氧气，而且很大程度上依赖于 PI3K 和 MAPK 通路。高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐珠单抗治疗组的PI3K和MAPK信号通路受到抑制，可以解释HIF-1α表达的降低。

已经观察到奥希替尼可以降低下游活化的p-EGFR的表达并影响PI3K/AKT/mTOR和Ras-Raf-MAPK的双重信号通路。这与先前关于单药奥希替尼在体内和体外实验中的作用机制的研究一致[15]。贝伐单抗的联合加强了这两条信号通路的抑制作用，这也从分子机制上解释了联合治疗为何能带来更多的肿瘤缩小。

综上所述，本研究通过移植瘤动物实验证实，第三代EGFR-TKI奥希替尼对EGFR突变的肺腺癌移植瘤具有较强的抗肿瘤作用，贝伐珠单抗可显着提高奥希替尼对肺腺癌的杀伤能力。具有EGFR突变的异种移植物，两者具有协同作用。贝伐珠单抗与奥希替尼的协同作用是通过降低肿瘤中VEGF的表达，改善肿瘤微环境，增强对EGFR下游信号通路激活的抑制来实现的。本研究为进一步的临床试验提供了理论依据。

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