一种检测吉非尼替耐药机理有效的方法有哪些？吉林新华明

一种检测吉非替尼耐药机制的方法

【技术领域】

[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及一种检测耐药机制的方法。

【背景技术】

[0002] 肺癌是我国乃至世界发病率最高、死亡率最高的恶性肿瘤。80%的肺癌是非小细胞肺癌。吉非替尼（）是治疗晚期非小细胞肺癌的有效药物。研究表明，与化疗相比，吉非替尼具有以下优势： 口服；毒副作用较小的治疗；可以达到与化疗相近的效果，甚至优于化疗。然而，晚期非小细胞肺癌患者服用吉非替尼10-12个月后可能会产生耐药性，导致服用该药物的患者出现药效降低的后果。虽然对吉非替尼的耐药机制有了一定的了解，但尚未发现导致耐药的原因，尤其是没有检测电阻的方法。对检测数据的研究发现了一种新药。非替尼耐药机制为延缓或克服吉非替尼耐药的发展提供了新的治疗策略。

[发明概要]

[0003] 本发明的目的是针对目前尚无检测吉非替尼耐药机制的有效方法的现状，找出耐药机制的原因，提出一种有效的检测耐药机制的方法。 的作用机制，为进一步研究抗药或方法提供参考依据。

[0004] 一种检测吉非替尼耐药机制的方法，其技术方案包括：?!)利用定量（同位素标记相对或绝对定量）蛋白质组学技术检测参与吉非替尼耐药的蛋白质信号分子进行高通量筛选；利用blot（ Test）技术验证吉非替尼敏感肺癌细胞系和吉非替尼耐药细胞系差异表达的蛋白质信号分子；龟使用MTT（思嘉 blue比色法，证明干扰已发现的蛋白质信号分子的表达可以增加吉非替尼的敏感性，从而证明新发现的蛋白质信号分子表达水平的变化是吉非替尼的抗性之一. 种机制。

[0005]本发明具有以下显着效果：通过本发明技术方案的实施，有助于检测新的与吉非替尼耐药相关的蛋白质信号分子，阐明吉非替尼耐药的新机制。获得的新蛋白信号分子用于设计抗耐药药物，以达到逆转吉非替尼耐药基础的目的。

【图纸说明】

[0006] 图 图1为定量蛋白质组学分析技术流程图。

[0007] 图 图2为blot技术的测试结果展示图。

[0008] 图 图3为MTT技术测试结果展示图。

【详细方式】

[0009]本发明的具体实施方式如下： 1、参与吉非替尼耐药蛋白信号分子的筛选。

[0010] 目前国际公认的定量蛋白质组学技术用于筛选与吉非替尼耐药相关的蛋白质信号分子。具体步骤包括：以人肺癌细胞系PC-9（正常肺癌细胞，对吉非替尼治疗敏感）为对照组，以人肺癌细胞系PC-9R（使用PC-9细胞系长期低剂量吉非替尼）作为对照组。处理，获得的吉非替尼耐药细胞株）为实验组，采用定量蛋白质组学技术筛选PC-9和PC-9R细胞株差异表达的蛋白质信号分子。定量蛋白质组学技术的具体技术流程如图1所示。

[0011] 2、 验证新发现的蛋白质信号分子是否在PC-9和PC-9R中差异表达。

[0012] 与PC-9相比，筛选中发现的PC-9R中表达上调的蛋白信号分子通过印迹技术验证其实际表达水平。印迹技术的主要步骤包括：蛋白质提取、蛋白质浓度测定、凝胶电泳、蛋白质转移膜、抗体孵育和蛋白质表达水平检测。

[0013] 3、 新发现的蛋白质信号分子参与了吉非替尼耐药性的验证。

[0014] 将干扰新发现的蛋白质信号分子表达的PC-9R和PC-9R本身用吉非替尼处理，用MTT法比较新发现的蛋白质信号分子是否受到干扰，而吉非替尼影响PC-9R的增殖，因此证实干扰新发现的蛋白质信号分子的表达可以增加PC-9R对吉非替尼的敏感性，进一步说明新发现的蛋白质信号分子介导了吉非替尼耐药并具有药物设计目标的潜在价值。

[0015] 如图1所示：定量蛋白质组学分析技术流程为：第一步分别从PC-9和PC-9R细胞样品中提取蛋白质；第二步是对提取的蛋白质样品进行还原。碱处理，打开二硫键，使后续步骤可以充分消化蛋白质；第三步，采用考马斯亮蓝法()法进行蛋白质浓度测定，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，每个样品取等量蛋白质，进行胰蛋白酶消化；第四步，用试剂标记肽段；第五步，将标记肽等量混合；第六步，对混合肽进行强阳离子交换，采用SCX进行预分离；第七步进行液相串联质谱（带质谱，LC-MS/MS）分析；第八步，数据分析：首先，对质谱仪的原始文件进行峰识别。获取峰值列表。其次，建立参考数据库来鉴定肽和蛋白质。最后，比较每个样品中每种蛋白质的相对含量，得到目标蛋白质。

[0016] 如图2：A1在PC-9R中的表达高于PC-9（颜色越深，表达水平越高）β-为内参，用于校准蛋白表达基准。A1的分子量为38.5kDa，0-的分子量为。

[0017] 如图3：研究对象使用对吉非替尼耐药的PC-9R细胞。因为它们对吉非替尼耐药，随着吉非替尼浓度的增加，PC-9R的增值率有所下降，但并不明显。如果先扰乱PC-9R细胞的A1表达水平，再使用吉非替尼进行治疗，随着吉非替尼浓度的增加，PC-9R细胞的增殖速度将受到明显抑制。说明A1参与了吉非替尼耐药，是吉非替尼耐药的新机制。同时也表明A1可以作为逆转吉非替尼耐药的靶点。

[0018] 表1 PC-9和PC-9R筛选得到的差异表达蛋白信号分子

注：按照上调率排名，A1位居第三。鉴于文献报道了上调率最高的前两种蛋白信号分子，本方案选择A1作为参与吉非替尼耐药的新信号分子进行申报。

[0019] 上调率：作为定量蛋白质组学结果的一部分，认为A1在PC-9R中的表达高于在PC-9中的表达，并且上调了1.倍.

[0020] 以上[附图说明]及表1中：PC-9为人肺腺癌细胞PC-9；PC-9R是人肺腺癌PC-9细胞细胞；SCX强阳离子交换是；nM 是每升纳摩尔吉非替尼的浓度；A1是膜联蛋白A1，它在PC-9R中的表达比在PC-9中表达的多（颜色越深，表达水平越高）。

【主权项】

1. 一种检测吉非替尼耐药机制的方法，其特征在于：该方法包括：利用定量（同位素标记相对或绝对定量）蛋白质组学技术检测吉非替尼耐药性高通量筛选蛋白质信号分子；这个; 利用blot（ test）技术验证筛选得到的吉非替尼敏感肺癌细胞系和吉非替尼耐药细胞系差异表达的蛋白信号分子；：MTT（四甲基唑蓝比色法）方法证明干扰新发现的蛋白质信号分子的表达可以增加吉非替尼的敏感性，从而证明新发现的蛋白质信号分子表达水平的变化是吉祥的。非替尼耐药机制。2.根据权利要求1所述的检测吉非替尼耐药机制的方法，其特征在于，高通量筛选蛋白信号分子的具体步骤包括：W人肺癌细胞系PC-9（正常肺癌）细胞，对吉非替尼治疗敏感）作为对照组，W人肺癌细胞系PC-9R（PC-9细胞系长期低剂量吉非替尼治疗获得吉非替尼耐药细胞系）为实验组，利用定量蛋白质组学技术筛选PC-9和PC-9R细胞系差异表达的蛋白质信号分子。3.根据权利要求1所述的检测吉非替尼耐药机制的方法，其特征在于：印迹技术验证的主要步骤包括：蛋白质提取、蛋白浓度测定、凝胶电泳、蛋白转移、抗体孵育和蛋白表达水平检测。4.根据权利要求1或2所述的检测吉非替尼耐药机制的方法，其特征在于：定量蛋白质组学分析技术流程为：第一步，分别从PC-9和PC-9R中提取蛋白质来自细胞样本；第二步是对提取的蛋白质样品进行还原烷基化，打开二硫键，使后续步骤可以充分酶解蛋白质；第三步，用考马斯亮蓝法（Bran ）法进行蛋白质浓度测定，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，每个样品取等量的蛋白质，并进行膜蛋白酶水解；第四步，用试剂标记皮肤片段；第五步，将标记的肽段等量混合；第六步，用强阳离子交换层析（，性）对混合肽段进行预分离；第四步，进行液相串联质谱（with mass，LC-MS/MS）分析；第八步，数据分析：

[专利摘要] 一种检测吉非替尼耐药机制的方法，属于医药领域。该方法包括：①利用定量（同位素标记相对或绝对定量）蛋白质组学技术高通量筛选与吉非替尼耐药相关的蛋白质信号分子；②使用？Blot（ blot test）技术验证，筛选吉非替尼敏感肺癌细胞系和吉非替尼耐药细胞系之间差异表达的蛋白质信号分子；③用MTT（四甲基氮唑蓝比色法）方法证明干扰已发现的蛋白信号分子的表达可以增加吉非替尼的敏感性，从而证明新发现的蛋白信号分子表达水平的变化是吉非替尼耐药的一种机制。

【IPC分类】/68

【公众号】

【申请编号】CN2

【发明人】王彦阳、赵仁、哲红

【申请人】宁夏医科大学总医院

【出版日】2016年4月20日

【申请日期】2016年2月1日